[发明专利]小麦背景中长穗偃麦草染色体特异标记及其应用

权利要求书

1.小麦背景中长穗偃麦草染色体特异标记，其特征在于步骤： 

(1)利用SDS酚-氯仿法微量提取基因组DNA； 

(2)长穗偃麦草特异片段的PCR扩增； 

(3)长穗偃麦草特异扩增片段的回收； 

(4)氯化钙法制备感受态细胞； 

(5)菌落PCR； 

(6)长穗偃麦草染色体特异SCAR标记的建立； 

所述引物根据长穗偃麦草的EST序列设计固定引物，根据SRAP引物设计随机引物，由固定引物和随机引物随机组合共56对引物，利用18条基础引物组合了56个引物组合后进行PCR扩增，选择出21个具有长穗偃麦草特异扩增的引物组合。 

2.根据权利要求1所述的小麦背景中长穗偃麦草染色体特异标记，其特征在于步骤(1)利用SDS酚-氯仿法微量提取基因组DNA中，其步骤如下： 

(1-1)取幼嫩叶片(约0.1g)，剪碎装入2ml的离心管中，置于液氮中冷却，用研磨棒碾碎至粉末状； 

(1-2)离心管放置于室温稍冷却，加入700μl的缓冲液A，轻轻混匀，然后65℃水浴20min，期间每隔5min上下颠倒混匀一次； 

(1-3)取出稍冷却至室温，加入苯酚和氯仿各350μl，上下颠倒，充分混匀，抽提5min； 

(1-4)12000rpm，离心10min，将上清液吸取到一个新的离心管中； 

(1-5)加入约750μl氯仿，上下颠倒，充分混匀，抽提5min； 

(1-6)12000rpm，离心10min，将上清液吸取到一个新的离心管中； 

(1-7)加入约560μl异丙醇，轻慢混匀，室温放置10min，可见絮状沉淀； 

(1-8)12000rpm，离心10min，弃去上清液； 

(1-9)加500μl70％的乙醇溶液洗涤两次，每次2-3min.室温晾干； 

(1-10)晾干的DNA溶解于20μlTER中，37℃温浴45min.-20℃保存备用。 

3.根据权利要求1所述的小麦背景中长穗偃麦草染色体特异标记，其特征在于步骤(2)长穗偃麦草特异片段的PCR扩增中，其步骤如下： 

(2-1)依据引物组合进行PCR扩增； 

(2-2)PCR反应结束后以6％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物。 

4.根据权利要求1所述的小麦背景中长穗偃麦草染色体特异标记，其特征在于步骤(3)长穗偃麦草特异扩增片段的回收中，步骤如下： 

(3-1)用刀片将含有特异扩增片段的聚丙烯酰胺凝胶胶条从胶板上割下，放入1.5ml离心管中，加入TEO.1200μl，浸泡30min，用移液枪去除液体，重复2次： 

(3-2)加入200μlddH20，浸泡30min，用移液枪去除液体； 

(3-3)加入30μlddH20，100℃水浴10min； 

(3-4)将胶块捣碎，100℃水浴10min； 

(3-5)3700rpm，离心15min，20μl的PCR反应体系中加入3μl上清液作为模板，采用相应引物相同PCR程序对其进行扩增； 

(3-6)以割胶回收的条带为模板PCR扩增产物与首次PCR扩增得到的对应产物，同时进行1％琼脂糖凝胶检测，若两者的电泳迁移率相同，则割胶回收的条带为目的产物； 

(3-7)将1％琼脂糖凝胶上证明正确的目的产物与pMD18/19-T载体连接，具体步骤如下：在微量离心管中加入1μl的pMD18/19-T载体，加入0.1pmol至0.3pmol样品DNA，用ddH20定容至5μl，再加入5μl等量的Solutionl。16℃反应30min，并且4℃过夜。