[发明专利]猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡及其制备方法和应用

说明书

 

技术领域

本发明涉及一种检测试纸卡及其制备方法，具体涉及一种猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡及其制备方法和应用。

背景技术

猪伪狂犬病，是由猪伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus，PRV）引起的以怀孕母猪繁殖障碍、新生仔猪高热和神经僵直症状为特征的一种烈性传染病，可达100%的高死亡率。由于猪是该病最主要的贮存宿主，病猪和带毒猪均为本病的传染源，且流行范围遍及世界，严重危害着世界养猪业发展。

本病的检测方法较多，主要有ELISA和PCR等，但这些方法存在操作复杂、需要专门仪器和人员、检测时间长等缺点，胶体金免疫层析方法是在免疫渗滤的基础上发展起来的快速检测方法，该方法操作简单、重复性好、灵敏度高，结果快速直观、并可大量制备，工艺简单、成本低廉，适合基层大批量现场检测。而且，目前这些方法多检测PRV抗原和IgG抗体，很少检测IgM抗体。而gE蛋白是PRV重要的糖蛋白，但其不是病毒增殖必须的蛋白，很多疫苗将便将其作为基因缺失疫苗的缺失段。因此gE IgM抗体的胶体金免疫层析法检测能快速有效区分野毒早期感染，为该病的早期诊断和预防以及猪场的净化提供了一种快速简便的方法。

发明内容

本发明的首要目的在于弥补现有检测技术的缺点与不足，提供一种猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡。该检测试纸卡将样品吸收区纯化的猪伪狂犬病毒gE蛋白作为检测抗原，特异性结合待检血清中猪伪狂犬病毒gE蛋白的IgM抗体，再结合胶体金标记抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体，固化抗体区检测线处包被的鼠抗猪IgM单克隆抗体进行捕获，利用夹心法进行猪伪狂犬病毒gE IgM抗体的检测。

本发明的另一目的在于提供上述猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡在猪群PRV早期感染诊断中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡，包括样品吸收区、金标探针区、固化抗体区、吸水区、底板和卡壳，样品吸收区、金标探针区、固化抗体区和吸水区依次粘贴于底板并相互重叠装入卡壳内；所述的样品吸收区包被有纯化的猪伪狂犬病毒gE蛋白，其包被量优选为1～50μg；所述的金标探针区包被有金标探针，所述的金标探针为胶体金标记的抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体，其标记量优选为每毫升胶体金标记1～30μg单抗，包被量优选为10～50μL/cm；固化抗体区依次有检测线T和对照线C，检测线T包被有鼠抗猪IgM单克隆抗体，包被量优选为0.1～10μg/cm，对照线C包被有羊抗鼠IgG，包被量优选为0.1～10μg/cm。

所述的样品吸收区的材料为聚酯纤维膜；所述的金标探针区的材料为玻璃纤维膜；所述的固化抗体区的材料为硝酸纤维素膜；所述的吸水区的材料为吸水滤纸；所述的底板的材料为聚乙烯板；所述的卡壳为带可视窗和样品孔的塑料卡壳。

上述猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡的制备方法，包括如下步骤：将纯化的猪伪狂犬病毒gE蛋白包被于聚酯纤维膜上；将胶体金标记的抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体喷涂于玻璃纤维膜上；将鼠抗猪IgM单克隆抗体包被于硝酸纤维素膜检测线T处，将羊抗小鼠IgG包被于硝酸纤维素膜对照线C处。将聚酯纤维膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装到聚乙烯板上，装入卡壳内，得到猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡。

优选的，所述的猪伪狂犬病毒gE IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡的制备方法，包括如下步骤：

（1）纯化的猪伪狂犬病毒gE蛋白的制备：

1）提取猪伪狂犬病毒基因组，参照GenBank发表的登陆号为AF403050.1 PRV广东株基因序列，针对gE基因设计引物：

上游引物：5^，-ATGGATTCATGCTGAGGGAGGCACCCCCG-3^，，

下游引物：5^，-CGAAGCTTTAATAACGGCCGGTCGCCCAC-3^，；

2）用步骤1）所述的基因设计引物扩增基因片段后克隆到pGEM-T-Vector上，再将克隆后的基因片段插入PET-32a原核表达载体，构建pET-32a-gE重组表达载体；