[发明专利]血管紧张素、血管紧张素醋酸盐的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药领域。更具体地，本发明涉及血管紧张素、血管紧张素醋酸盐的制备方法。

背景技术

血管紧张素(或血管紧张素胺)为增血压药，英文名angiotensinamide或[Asn¹，Val⁵]-angiotensinⅡ，化学结构为L-Asn-L-Arg-L-Val-L-Tyr-L-Val-L-His-L-Pro-L-Phe，是由八个氨基酸残基组成的合成多肽，理论分子量1031.18。血管紧张素用于外伤或手术后休克和全身麻醉或腰椎麻醉时所致的低血压症等，可预防或治疗围手术期低血压，作为急救用药治疗休克期低血压，也可用于治疗血管紧张素转换酶抑制剂用药过量且常规治疗无效时。

鞣酸加压素，是由九个氨基酸残基组成的合成多肽，其化学结构为L-Cys-L-Tyr-L-Phe-L-Gln-L-Asn-L-Cys-L-Pro-L-Arg-L-Gly(1→6)-二硫键鞣酸盐，加压素的理论分子量1084.24。鞣酸加压素为抗利尿激素药，能促进远端肾小管及集合管对水分的重吸收而具有抗利尿作用，其制剂临床用于治疗尿崩症。

醋酸奥曲肽(Octreotide acetate)，是由七个氨基酸残基和一个苏氨醇组成的合成多肽，化学结构为D-苯丙氨酰-L-半胱氨酰-L-苯丙氨酰-D-色氨酰-L-赖氨酰-L-苏氨酰-N-[2R-羟基-1R-(羟甲基)丙基]-L-半胱氨酰胺环(2→7)-二硫键醋酸盐，奥曲肽的理论分子量为1019.26，其原料药冻干粉中醋酸含量为5％～12％。醋酸奥曲肽可抑制生长激素，抑制胃肠胰脏分泌多肽等，其制剂临床用于需要长期奥曲肽治疗的活动性肢端肥大症，如术后生长激素残留致血清生长激素水平增高，垂体外照射放射治疗后尚未达到充分疗效的血清生长激素水平升高，部分不适合手术治疗及新诊断生长激素分泌腺瘤患者的术前治疗。

目前已上市多肽药物常见的纯化方法大都采用了制备型高效液相色谱法，该法是获得高纯度多肽目标分子的最有效的方法，也是我们固相合成血管紧张素纯化和脱盐的主要技术手段。一般多肽药物纯化制备工艺设计是先中低压色谱富集目标多肽，然后高压色谱精制，但是考虑到我们目标多肽血管紧张素分子量约1kD，无合适的分子筛凝胶柱(其上样量小，流速低，处理量小，比较适合分子量大于10kD蛋白的脱盐)或超滤膜选择。而且中低压色谱中常用的分离方法有分子筛色谱法、离子交换色谱法和疏水相互作用色谱法，这些色谱方法中用到的填料的粒径通常从几十微米到几百微米不等，空隙尺寸多为几百纳米不等，无法得到高纯度的目标多肽。如果采用高盐洗脱，后期处理无法找到合适的脱盐方案，分离纯化效果也有限，样品损失很大，回收率计算也较复杂，对于后期反相制备很不利。现在还缺乏一种有效的制备多肽盐原料药的方法，因此仍然迫切需要开发新的多肽盐的纯化工艺。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于为了克服现有技术中多肽盐的制备工艺复杂、收率低的缺陷，而提供了一种多肽、多肽盐的制备方法。本发明的多肽盐的制备方法以多肽为起始原料，经过高压反相色谱纯化和脱盐步骤，制备高纯度的多肽盐、特别是血管紧张素醋酸盐、鞣酸加压素和醋酸奥曲肽的方法。

发明人经过反复的研究发现，目前高压反相色谱法经典纯化的填料是硅胶基质，其柱效好，分辨率高，但色谱条件pH2-7耐受较窄；而安捷伦聚合物填料PLRP-S为苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物，可耐受较宽阔的pH范围(pH范围可达1-14)，并且可用1M NaOH溶液再生，也可以精准控制孔径大小与孔径形态，使得溶质分子无障碍扩散，相对于硅胶基质，其增加了有效表面积，能保持很好的柱效和分辨率，且提升了填料的载样量。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：

本发明提供了一种多肽的制备方法，其包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法将多肽粗品溶液依次进行反相纯化、反相脱盐，即可；高效液相反相色谱法的填料为苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物。

其中，所述的多肽粗品可为本领域的各种多肽粗品，较佳地为碱性多肽粗品，更佳地为血管紧张素粗品、加压素粗品或奥曲肽粗品。所述的血管紧张素粗品较佳地为专利申请CN201210131066.5公开的采用固相法合成的血管紧张素粗品，HPLC纯度为80～90％；所述的加压素粗品较佳地为专利申请CN201210131067.X公开的采用固相法合成的加压素粗品，HPLC纯度为80～90％；所述的奥曲肽粗品较佳地为采用固相法合成制得的奥曲肽粗品，HPLC纯度为80～90％。