[发明专利]抗原特异性不成熟DC来源外泌体及其制备和应用方法

说明书

发明名称

本发明属于治疗重症肌无力的药物或制剂的技术领域，具体涉及一种抗原特异性不成熟DC来源外泌体和制备方法，及其在制备治疗重症肌无力药物中的应用。

背景技术

重症肌无力(Myasthenia Graves,MG)是常见的神经系统自身免疫性疾病。其发病率为(0.5-5)/10万，患病率为10/10万，且目前仍呈上升趋势。临床表现为全身骨骼肌的波动性易疲劳，症状晨轻暮重，严重时可累及呼吸肌而危及生命。该病易复发，难以根治，显著影响患者的生活质量和生存。传统的治疗方法包括胸腺切除，血浆置换，和应用非特异的免疫抑制药物，这些方法副作用多且不能有效阻止MG的复发和进展。MG的治疗目标应当是抑制抗原特异性的免疫反应，同时保留免疫系统的其它功能，因此具有免疫调节功能的生物疗法对治疗MG具有更为重要的临床意义。且目前尚无针对MG的抗原特异性生物疗法。

树突状细胞(dendritic cells,DCs)是目前已知的体内调节功能最强大的抗原提呈细胞。DC的成熟状态决定着体内免疫反应的方向。成熟DC表面高表达MHC II，以及CD80，CD86等共刺激分子，能促使T细胞活化，使其分化为效应性T细胞和记忆性T细胞，在治疗肿瘤和特殊病原体感染疾病的动物模型中显示了巨大的应用前景。而不成熟DC表面低表达MHC II，以及CD80，CD86等共刺激因子，与T细胞作用时不能给予足够的刺激从而导致T细胞凋亡，无能或者耐受，这使得人们思考能否将不成熟DC用于移植排异或者自身免疫性疾病的治疗。然而，不成熟DC具有不稳定的特点，它在体内和体外均易受到炎症因子的刺激而分化成熟，从而丧失其治疗效果。另外，不成熟DC作为细胞性的疫苗，其在体外的储存难度大。这一切限制了DC作为疫苗在自身免疫性疾病治疗中的应用。

外泌体(exosomes)是由活细胞分泌的，直径为30-100nm的囊状小体。外泌体能反应其分泌细胞的功能。不同DC分泌的外泌体具有以下共同特点，首先它是非细胞性疫苗，具有可以冷冻储藏的优点。其次，将DC来源的外泌体注入体内后其表面分子不会像DC那样经历表型变化，并且，Dex疫苗在体内发挥作用不受杀伤性T细胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)细胞的影响。且在其应用于抗肿瘤的免疫治疗中，其副作用轻微且可耐受。不成熟DC来源的外泌体除了具有上述优点外，其表面低表达MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子能导致T细胞无能或低能反应，能诱导免疫耐受。Pêche等人先后证实了在小鼠心脏移植手术中，不成熟DC来源的外泌体能调节受者的抗移植免疫反应，并能显著延长同种异体心脏的存活时间。在自身免疫性疾病的治疗中，通过基因工程技术将表达IL-4，IL-10,FasL，吲哚胺2，3-加双氧酶(indoleamine2，3-dioxygenase，IDO)和CTLA-4Ig转染入髓源DC中，其来源的外泌体均能够抑制小鼠迟发型超敏反应的炎症进展，阻止类风湿性关节炎的病情进展。然而，这些实验使用的未成熟DC并不具有抗原特异性，因此它无法对自身免疫性疾病产生抗原特异性治疗，不能达到最佳的治疗效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗原特异性不成熟DC来源外泌体及其制备和应用方法。该抗原特异性不成熟DC来源外泌体能够用于治疗重症肌无力，而且具有制备方法简单、易于储备、稳定性强、效果显著、特异性强、副作用小等优点。

本发明的抗原特异性不成熟DC来源外泌体的制备方法，是将髓源性DC用microRNA-146a mimics干扰其成熟，再负载MG的致病肽段Tα_146-162得到抗原特异性不成熟DC，然后依靠抗原特异性不成熟DC分泌得到外泌体。

具体包括以下步骤：

1)先将microRNA-146a mimics和HiperFect载体混合温育，再加入含GM-CSF的RPMI1640完全培养基培养至第5天的髓源性DC；6小时后更换含GM-CSF的RPMI1640完全培养基；

2)然后将肽段Tα146-162加入步骤1)得到的转染microRNA-146a mimics后的不成熟DC中，培养48小时后，无菌条件下收集培养上清液，离心过滤纯化得外泌体。

上述方法更具体包括以下步骤：