[发明专利]StNHX1基因表达盒、应用及耐盐转基因大豆培育法

权利要求书

1.一种Na⁺/H⁺逆向转运蛋白StNHX1基因表达盒，其特征在于：该表达盒序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的逆向转运蛋白StNHX1基因表达盒的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

1)设计引物，扩增序列为SEQ ID NO.1所示的StNHX1基因片段；其中，上游引物P1:如SEQ ID NO.3所示；下游引物P2:如SEQ ID NO.4所示；

2)将StNHX1基因连接到pMD19-T质粒载体，转化TOP10感受态细胞，提取阳性重组质粒，进行BamHI和SacI双酶切，回收StNHX1基因片段；

3)进行植物表达载体pBI121BamHI和SacI双酶切，回收pBI121大片段；

4)以连接酶连接上述回收的StNHX1基因片段和pBI121大片段，形成连接产物，以连接产物转化TOP10感受态细胞，37℃过夜培养，挑取单克隆扩大培养，筛选转化子；

5)提取步骤4)中转化子的重组阳性质粒进行EcoRI及HindIII双酶切，回收小片段，即得到StNHX1基因表达盒；

其中，步骤2)、3)和步骤5)中双酶切体系为：50μL反应体系，10×Buffer1 5μL，BSA0.5μL，DNA15μL，BamHI1.0μL，SacI1.0μL，ddH₂O补至50μL；37℃反应2h，双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析进行回收；

步骤4)中连接反应体系为：10×T₄ligase Buffer2.5μL，pBI121大片段2μL，StNHX1基因片段8μL，T₄DNA连接酶1μL，ddH₂O补至25μL。

3.StNHX1基因在耐盐转基因植物培育中的应用，优选地，在耐盐转基因大豆培育中的应用。

4.一种耐盐转基因大豆的培育方法，其特征在于将野生茄子Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因StNHX1构建至植物表达载体pCAMBIA3301中，获得重组植物表达载体pCAMBIA3301-StNHX1，通过农杆菌介导的方法将重组表达载体导入大豆；具体包括如下步骤：

1)重组植物表达载体pCAMBIA3301-StNHX1的构建

将野生茄子StNHX1基因表达盒构建至植物表达载体pCAMBIA3301中，形成重组植物表达载体pCAMBIA3301-StNHX1；

2)StNHX1转基因大豆转化体的获得

农杆菌介导大豆子叶节方法，将重组植物表达载体pCAMBIA3301-StNHX1导入大豆基因组中，通过除草剂Bialaphos筛选获得T₀代转化体；

3)StNHX1转基因大豆T₃代阳性植株的获得

T₀代植株通过自花授粉获得T₁代种子，T₁代种子萌发后通过PCR及GUS染色鉴定出阳性植株，阳性植株自花授粉获得T₂代种子；T₂代阳性植株自花授粉获得T₃代种子；T₃代种子萌发后通过同样的方法鉴定出阳性植株。

5.一种重组植物表达载体pCAMBIA3301-StNHX1，其特征在于含有权利要求1所述的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因StNHX1表达盒和除草剂抗性基因bar基因，Na⁺/H⁺逆向转运蛋白StNHX1基因表达盒位于载体pCAMBIA3301的EcoR I和HindIII位点之间。

6.权利要求5所述的重组植物表达载体pCAMBIA3301-StNHX1，在耐盐转基因大豆培育中的应用。

7.一种宿主菌，其特征在于含有权利要求5所述的重组植物表达载体pCAMBIA3301-StNHX1。

8.权利要求7所述的宿主菌在耐盐转基因植物培育中的应用，优选地，在耐盐转基因大豆培育中的应用。