[发明专利]一种在钛表面构建层粘连蛋白/肝素/SDF-1α抗凝及诱导内皮化多功能层的方法

说明书

所属技术领域

本发明涉及无机材料表面改性技术，特别涉及人工器官材料钛表面的生物化改性方法。

背景技术

钛(Ti)及钛合金材料因其良好的生物相容性已广泛应用于医疗器械领域，如骨材料、牙种植体、外周血管支架等。但对于一些特殊应用的领域，如作为心血管植入材料用于冠心病的治疗，其安全性和生物相容性还远未达到临床要求。其中，Ti材料血液相容性差、细胞相容性不足以及对于血管内膜增生和炎症反应等并无显著抑制作用是制约其应用的主要方面。

通过对材料表面进行生物化改性，构建合理的生物微环境，赋予材料良好的抗凝血能力和诱导内皮再生能力是改善其生物相容性的有效方法。层粘连蛋白(Ln)是血管内皮基底膜中所特有的非胶原糖蛋白，能有效促进血管内皮细胞的粘附、迁移和增殖。间质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)是一种对骨髓CXCR4+干细胞及内皮祖细胞(EPCs)具有强烈趋化作用的趋化因子，同时也具有刺激内皮细胞生长，诱导内皮祖细胞向内皮细胞分化的功能。肝素(Hep)是一种广泛使用的抗凝血药物，临床也常用于免疫炎症反应的预防和治疗。此外，Hep能够结合多种功能蛋白，如Ln和SDF-1α，肝素与蛋白质的相互作用可以增强蛋白质的生物学活性，延长其作用时间。

多聚赖氨酸(PLL)是一种富含氨基的氨基酸聚合物，在中性环境下呈强正电性，通过静电作用可牢固结合于碱热活化后呈负电性的Ti表面，并在表面引入大量具有反应活性的氨基。通过EDC/NHSMES偶联剂的作用，可将Ln/Hep复合物共价固定于氨基化的Ti表面。利用Hep特异性结合SDF-1α的特点，可在共固定Ln/Hep的表面进一步引入SDF-1α。

这种Ln/Hep/SDF-1α多功能层能显著提高在材料表面的血液相容性，同时诱导骨髓和血液来源的内皮祖细胞在材料表面粘附增殖，促进血管内皮细胞的再生，刺激损伤修复。而目前尚无将Ln/Hep/SDF-1α生物微环境用于Ti材料表面生物化改性的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在Ti材料表面构建Ln/Hep/SDF-1α抗凝及诱导内皮化多功能层的方法，通过该方法对Ti材料表面进行生物化改性可有效提高材料的血液相容性和诱导内皮再生能力。

本发明实现以上目的采用的技术方案是，一种在钛表面构建Ln/Hep/SDF-1α生物微环境的方法，其步骤包含：

A、碱热活化纯钛经表面抛光和清洗处理后，浸入浓度为1～5mol/L的NaOH溶液中，在60～90℃条件下反应8～16小时，单蒸水超声清洗后，浸入双蒸水中，60～90℃条件下反应8～16小时，单蒸水超声清洗后，37℃烘干；

B、表面氨基化将A步骤中碱热活化的样品浸泡于0.5～3mg/ml的多聚赖氨酸(PLL，MW150～300KDa)溶液中，在4℃条件下静置反应8～24小时，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗样品，保存待用；

C、层粘连蛋白/肝素的共固定首先将浓度为30～300μg/ml的层粘连蛋白溶液与浓度为3～10mg/ml的肝素钠溶液等体积共混，37℃条件下静置孵育1～3小时；配置摩尔比为2:1:1的EDC/NHS/MES(0.05mol)缓冲液，以1:10的体积比加入至层粘连蛋白/肝素的混合液中，室温下静置1～5分钟；然后将B步骤中涂覆有PLL的钛片浸泡于上述层粘连蛋白/肝素钠混合液中，37℃条件下静置反应3～6小时；最后用PBS漂洗样品，保存待用；

D、SDF-1α的装载将C步骤获得的样品浸入50～500ng/ml的SDF-1α溶液中，在4℃条件下静置反应8～24小时，PBS漂洗后即得目标物。

参见说明书附图1，本发明的反应过程与机理分为两个部分，第一部分为氨基化Ti表面的获得。首先通过碱热活化在Ti表面引入大量的羟基，使表面呈强负电性；其次在pH＝7.4的PBS体系中，正电性的PLL分子通过静电作用牢固吸附于碱活化Ti表面，从而在表面引入丰富的氨基用于后续生物分子的固定。第二部分为Ln/Hep/SDF-1α在Ti表面的固定。首先将Ln与Hep溶液共混，利用Hep与Ln相互作用的特性使两种生物分子充分结合，然后使用EDC/NHS/MES偶联剂活化Ln/Hep复合物中的羧基，并于氨基化Ti表面的伯氨基发生脱水缩合反应，从而使Ln/Hep共价固定于Ti表面，最后利用Hep与SDF-1α能发生结构域上的结合的特性，将SDF-1α装载于固定Ln/Hep的Ti表面。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：