[发明专利]一种基因载体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种含金属纳米材料和阳离子聚合物的基因载体及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，随着人类基因组计划的进展及对功能基因的不断探索，基因治疗的研究受到越来越多人的关注，基因治疗自20世纪八十年代进入临床试验以来，其应用已从遗传性病症的治疗扩展到获得性疾病的防治，如组织工程与再生医学等。对于基因重组及基因转染而言，安全性好且能产生基因高效、定位表达的载体是构建载体的关键所在。

目前常用的基因转染载体有病毒型和非病毒型两种。病毒载体有高效传递和表达基因的能力，但存在制备复杂、生物安全性低和非导向性的特点。对于创伤、烧伤、辐射等非内源性疾病导致的急性皮肤损伤，病毒载体转染后，目标基因在宿主体内长时间的高效表达在组织修复以后会给机体带来不利的影响和潜在的致癌风险。相比之下，非病毒载体介导外源性基因瞬时表达的特点更适于急性创伤的基因给药。此外，低毒、低免疫原性、相对靶向性和制备简单等优点也使非病毒载体的应用越来越广。但与病毒载体不同，结构简单的非病毒载体很难帮助基因穿过从细胞外到细胞内的所有屏障从而实现基因的高效表达。传递效率低，基因表达不稳定是非病毒载体应用过程中亟待解决的问题。

公布号为CN103320471A的专利文献公开了一种非病毒基因载体，包括超支化乙烯亚胺、金银合金纳米颗粒；所述金银合金纳米颗粒以硫金键和硫银键与超支化聚乙烯亚胺结合。本发明提供的非病毒基因载体能够与基因物质较好的复合，将基因物质导入细胞进行表达，并实现治疗的目的。该发明中的超支化聚乙烯亚胺与基因物质能够良好的复合，且金银合金纳米颗粒能够促进基因的转染，提高了基因的转染效率。

上述专利文献所公开的非病毒基因载体虽然能够提高基因的转染效率，但其生物毒性却较高。以聚乙亚胺为材料合成的载体虽然能够显著提高转染效率，但由于该材料容易被细胞内的酶类分解产生有毒物质，所以具有较高细胞毒性。因此如何能够在保证基因载体具有高转染率的同时降低细胞毒性是一个非常重要的研究课题。

发明内容

本发明的目的在于针对目前现有技术中的不足之处，提供一种转染效率高、毒性低的基因载体。

本发明提供了一种基因载体，包括作为核心的金属纳米颗粒以及连接在金属纳米颗粒表面的阳性聚合物，所述阳性聚合物为多聚赖氨酸。

多聚赖氨酸(PLL)是一种阳离子聚合物材料，其作为基因载体组成部分，能够在正负电荷相互吸引的静电作用下，与带负电荷的DNA分子结合，可以将质粒由几百纳米的松散线性分子压缩成直径数十纳米的致密颗粒。并且，与其它基因转染试剂相比，多聚赖氨酸拥有较高的生物相容性、具有较低的细胞毒性。

所述基因载体的粒径为13～37nm，表面电荷为23～30mV。

多聚赖氨酸的分子量影响基因载体及DNA复合物的粒径，分子量过大会导致复合物无法穿过细胞膜，所述多聚赖氨酸的分子量选用60000～300000道尔顿较为适宜。

穿膜肽(TAT)是一些具有细胞膜穿透能力的小分子多肽，可携带比其分子量大100倍的外源性疏水大分子进入细胞，毒副作用小。因此优选的，所述金属纳米颗粒表面连接有穿膜肽。

穿膜肽的分子量及数量影响基因载体的转染效率，所述穿膜肽的分子量优选为100～10000道尔顿；所述穿膜肽与金属纳米颗粒的质量比优选为0.5～100。

所述穿膜肽的氨基酸序列为CCYGRKKRRQRRR，该氨基酸序列的穿膜肽能够高效地帮助基因载体穿透细胞膜，从而提高整个基因载体的转染效率。

所述金属纳米颗粒为金纳米颗粒或银纳米颗粒；金纳米颗粒(Au)和银纳米颗粒(Ag)，具有独特的物理化学特性，如粒径小、光学特性、比表面积和表面电荷高、易于修饰等优势，以它们作为核心，与阳性聚合物连接，能够显著提高基因载体的转染效率。

本发明还提供了一种基因载体的制备方法，包括：

将多聚赖氨酸加入金属离子溶液中混合均匀，然后在搅拌条件下加入还原剂进行氧化还原反应，反应完成后从反应液中分离获得所述基因载体。

所述的还原剂为NaBH₄；所述的金属离子溶液分别为HAuCl₄溶液或AgNO₃溶液。

所述制备方法中多聚赖氨酸与HAuCl₄溶液或AgNO₃溶液的反应时间为0.5-100h，反应温度为10-200℃。