[发明专利]一种高温酸性β-甘露聚糖酶Man5DW1及其基因和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域。具体地，本发明涉及一种高温酸性β-甘露聚糖酶Man5DW1及其基因和应用。

背景技术

植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素及木质素等物质构成。甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分，是由β-1，4-D-甘露糖连接而成的线状多聚体，在多糖的侧链上主要有葡萄糖基、乙酰基和半乳糖基等取代基团。β-甘露聚糖酶(β-mannanase EC3.2.1.78)是一种水解甘露聚糖的内切水解酶，以内切方式降解甘露糖主链β-l,4糖苷键，释放出短的β-l,4甘露寡糖。

近年来，随着甘露寡糖生理功能的发现，绿色饲料的兴起以及人们环保意识的增强，能源的再生利用研究，人们对β-甘露聚糖酶的研究和利用已进入了一个新的阶段。β-甘露聚糖酶已被广泛应用于食品、医药、饲料、造纸、纺织印染、石油开采、精细化工及生物技术等诸多领域，是一种新型的工业酶，具有很大的潜在应用价值。

β-甘露聚糖酶广泛存在于细菌、放线菌、真菌、植物、动物等生物中。细菌来源的甘露聚糖酶主要是酸偏中性的甘露聚糖酶。其分子量多在35kDa～55kDa之间，最适反应作用温度为50℃～70℃。目前研究最多的是芽孢杆菌，除嗜碱性芽孢杆菌的最适作用pH达到pH9.0以上，大多最适反应pH在5.5～8.0之间。真菌的β-甘露聚糖酶一般呈酸性，分子量大约在45kDa～55kDa，最适作用pH为4.0～6.0，最适作用温度为55℃～75℃。相对细菌而言，真菌来源的β-甘露聚糖酶最适反应pH值、pH稳定性都偏低，耐热性比细菌差。

细菌中的甘露聚糖酶一般都有较好的耐热性.最佳反应温度50～70℃，真菌产生的酶最适反应温度为55～75℃。但耐热性较芽孢杆菌的要差。植物源的甘露聚糖酶最适温度则接近常温，耐热性比细菌和真菌源的都要差。耐热甘露聚糖酶提高了其在工业中的应用价值。

目前国内外，虽然许多β-甘露聚糖酶被克隆分离及性质测定，但这些酶的性质特征，均存在一些缺陷，例如，pH作用范围不合适，热稳定性差，表达量低等，均不能满足实际应用的需要。因此人们希望能够找到一种新的能够满足实际应用需求的β-甘露聚糖酶，从而能够进一步推广该β-甘露聚糖酶在饲料、食品、医药等行业中应用。

本发明从雪莲土中分离的Alternaria sp.菌株中得到了一个新的β-甘露聚糖酶基因，其编码的甘露聚糖酶具有以下几个优点：酸性、高温、良好的热稳定性、强的金属离子抗性、容易发酵生产。所有这些优点都意味着新发明的β-甘露聚糖酶在饲料、食品、医药等行业中，将会更有应用价值比以前所报道的β-甘露聚糖酶。

发明内容

本发明的目的是提供一种酸性、高温、良好的热稳定性的β-甘露聚糖酶。

本发明的再一目的是提供上述β-甘露聚糖酶的基因。

本发明的再一目的是提供包含上述β-甘露聚糖酶的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种制备β-甘露聚糖酶的方法。

本发明的再一目的是提供上述β-甘露聚糖酶的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、医药等行业中应用的新的高温β-甘露聚糖酶。该β-甘露聚糖酶Man5DW1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1：

其中，该酶全长374个氨基酸，N端15个氨基酸为信号肽序列“MKLLSILSLCATAAA”。

因此，成熟的β-甘露聚糖酶Man5DW1的理论分子量为39.5kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2：

该β-甘露聚糖酶Man5DW1同时具有酸性、高温等特点。最适pH为5.0，在pH3.5-pH9.0范围内，该酶能够维持其40％以上的酶活力；最适温度70℃，在40℃-80℃范围内，具有40％以上的酶活力，该酶属于高温酶，在60℃下处理60min，酶活基本没有损失，即使该酶在65℃下处理20min，依然能够保持30％的酶活力，具有很好的稳定性；具有极好的抗金属离子和化学试剂的能力；同时高密度发酵酶活性高，易于工业化生产。

本发明还提供了编码上述β-甘露聚糖酶的基因。该酶的全基因序列如SEQ ID NO.3所示：