[发明专利]口服热淋清颗粒后肾脏组织两种化学成分的测定方法

权利要求书

1.口服热淋清颗粒后肾脏组织两种化学成分的测定方法，其包括以下步骤：

(1)测试样品的制备：

(a)取热淋清颗粒0.5～4g，加5～10倍水溶解，通过灌胃给药方式给予大鼠(体重230-270g)热淋清颗粒水溶液10ml/kg；

(b)分别在30～360min，后对大鼠进行断头处死，解剖并分离肾脏组织，称重，取肾脏组织0.1～0.5g，加5～10生理盐水，粉碎，3000～6000r/min离心，取上层组织溶液转移至新空白EP管中；

(c)加入内标岩白菜素母液10μl，然后按肾脏组织与沉淀试剂体积比为1：4～8沉淀蛋白，沉淀时间2～5min，涡旋混匀30～60s后，在0～10℃恒温条件下以10000～12000r/min离心5～15min(所述的沉淀试剂为乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)混合液并且添加1％～4％酸，所述酸选自甲酸、乙酸或其组合)

(d)将上层液转移至新空白EP管中，于30～50℃氮气流吹干，残留物用100μl流动相溶解，涡旋混匀30～60s后，在0～10℃恒温条件下以10000～12000r/min离心5～15min，取上清液即为供试品溶液；

(e)按步骤(b)至步骤(d)的方法对未服用药物的动物肾脏组织进行处理，得到空白溶液；

(f)对照品溶液的制备：分别精密称取没食子酸对照品、原儿茶酸对照品、岩白菜素对照品0.01～1mg，各自加纯甲醇定容至10ml，即得三种母液，分别取三种母液适量至同一量瓶中，加甲醇稀释至所需浓度，即为对照品溶液；

(2)LC-MS/MS分析的色谱条件和检测条件：

色谱柱为反相色谱柱，酸性乙腈或酸性甲醇：酸性水＝0～20:80～100(体积比)为流动相，流速为0.1～0.5mL/min，柱温为20～40℃，离子化方式为电喷雾条件，负模式监测，喷雾电压为2000～3000V，雾化温度为300～500℃，鞘气压力为30～50mTorr，辅助气压力为5～15mTorr，毛细管温度为200～400℃(所述的酸性乙腈或酸性甲醇或酸性水中，酸的浓度为0.05％～0.5％，所述酸选自甲酸、乙酸或其组合)；

(3)测定法：分别精密吸取对照品溶液、空白溶液与供试品溶液5～20μL，注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定，即得。

2.根权利要求1的方法，其中步骤(a)中，通过灌胃给药方式给大鼠(230～270g)热淋清颗粒水溶液2～4ml。

3.根权利要求1的方法，其中步骤(b)中，分别在30min，60min，2h，3h，6h后大鼠进行采血。

4.根权利要求1的方法，其中步骤(b)中，将样品于低速离心机5000r/min离心10min。

5.根权利要求1的方法，其中步骤(c)中，用酸度为2％酸性乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)按体积比1:4沉淀蛋白5min。

6.根权利要求1的方法，其中步骤(c)中，沉淀蛋白后涡旋均匀30s后4℃恒温离心，转速12000r/min，离心10min。

7.根权利要求1的方法，其中步骤(c)中，使用甲酸：乙酸＝2：1体积比混合酸来酸化沉淀试剂。

8.根权利要求1的方法，其中步骤(d)中，将上层清液于氮吹仪于40℃吹干。