[发明专利]NRAS基因突变检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及基因突变检测。具体地说，本发明涉及NRAS基因突变检测试剂盒，该试剂盒可用于检测与癌症有关的NRAS基因突变。

背景技术

Ras基因是一种原癌基因，最初从Harvey，Kirsten大鼠肉瘤病毒(rat sarcoma)中克隆所得，被称为HRas和KRas^[1]。后来将人神经母细胞瘤DNA感染NIH3T3细胞时发现另一种相似的基因，被称为NRas，三者是Ras基因家族最主要的成员^[2]。功能上Ras蛋白具有分子开关的作用，正常表达下，能够调控细胞生长。发生点突变，过表达或者基因易位等异常情况会导致细胞异常增殖，并最终引发肿瘤形成，超过30％的人类肿瘤存在Ras的突变^[3，4]。现在研究最为深入的是KRas，其过表达和突变普遍发生在甲状腺癌，乳腺癌等很多癌症中，在北美肺腺癌患者中，其突变率更是高达25％。并且KRas还与TKI耐药有关，所以它成为很多肿瘤诊断和治疗的分子标志，在临床上发挥了重要意义^[5，6]。作为Ras家族的另一成员，NRas在结构和功能上都与KRas具有很多相似性，并随着近年研究的加深，逐渐成为继KRas之后另一个为临床病情评估和治疗提供重要依据的分子指标。

NRas基因位于人类1号染色体短臂上(1p22-p32)，编码具有189个氨基酸p21蛋白^[7]。NRas蛋白与Ras家族其他蛋白具有高达85％同源性，这些高度保守的结构域包括对蛋白功能发挥起着极其重要作用的鸟苷三磷酸(guanosine triphosphate，GTP)和效应分子的结合域以及将NRas蛋白定位于质膜上的法尼基转移酶作用位点-C端的CAAX基序等^[8，9]。所以功能上NRas也具有很多RAS家族蛋白共同的特征：位于细胞膜内侧，属于一种低分子量G蛋白，对鸟苷酸具有很强的亲和性并具有GTPase活力；具有GTP结合(Ras.GTP)及GDP结合(Ras.GDP)两种构象，在一定条件下二者可以发生互变；当Ras蛋白与GDP结合时为失活状态，与GTP结合时，为活化状态，激活下游信号通路，由此在信号传导中起着极为重要的开关作用^[10，11]。NRAS激活的下游信号通路也是现在研究最为明确的RAS信号通路：PTK(protein tyrosine kinase)-Grb2(growth factor receptor-bound protein2)-Ras-Raf-MAPK(mitogen activated protein kinase)-ERK(extracellular signal-regulated kinase)通路^[12]。当外源刺激如生长因子(EGF)等与胞膜受体(EGFR)结合，使受体上相应的酪氨酸激酶磷酸化，磷酸化的酪氨酸残基与Grb2的SH2区结合后，招募鸟氨酸交换因子(SOS)与Grb2的SH3区结合形成复合物Grb2-SOS，该复合物与Ras结合并使Ras-GDP转变为Ras-GTP，从而激活Ras。激活后的Ras再激活下游Raf激酶，Raf激酶磷酸化MAPK，MAPK激活ERK。ERK被激活后，转至细胞核内，直接激活c-myc各种转录因子，从而参与细胞生长，发育，分裂及分化等多种生理过程^[13]。当NRas发生突变时，会导致下游Raf以及MAPK等的异常激活从而在肿瘤恶变中起重要作用^[14]。