[发明专利]基于猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种基于猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法。 

背景技术

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)为圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属成员，单股环状DNA病毒，为已知的最小动物病毒之一。根据基因组和抗原性的差异，分为PCV1和PCV2两种基因型(或血清型)，其中PCV1至今未发现有致病性，PCV2则被认定是导致仔猪断奶后多系统衰竭征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原。PCV2常与细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 、猪肺炎支原体、伪狂犬病毒(PRV)混合感染，造成猪的免疫失败。PCV1和PCV2的基因组包含有2个主要的开放阅读框，即ORF1和ORF2，病毒的主要结构蛋白由ORF2编码，ORF1基因编码Rep和较小的Rep′两种与复制有关的蛋白。将体外表达的ORF1编码蛋白与表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM2CSF)的真核表达质粒联合免疫猪群，能起到抵抗PCV2攻击的作用，这提示针对ORF1基因编码蛋白的抗体可能具有中和病毒的作用。PCV1与PCV2的ORF1阅读框同源性高达86%，目前大多数报道称PCV1无致病性，但已有报道称其可引起繁殖障碍，猪圆环病毒的免疫程序已经很成熟，但其带来的经济损失却持续增加，可以很好的解释PCV1的存在对PCV2的致病性有促进作用。 

目前，国内外对于PCV2基因工程疫苗包括PCV2亚单位疫苗和重组PCV2活载体疫苗。Cap蛋白是PCV2的主要结构蛋白和免疫保护性抗原,能刺激动物机体产生针对PCV2的特异性免疫应答,是研制PCV2基因工程亚单位疫苗的理想靶抗原。常用于PCV2亚单位疫苗生产的表达系统主要是昆虫细胞杆状病毒表达系统。其中重组PCV2活载体疫苗又包括PCV2病毒活载体疫苗和PCV2细菌活载体疫苗。 

发明内容

本发明的目的是：提供一种基于猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法，它所制备或的疫苗能有效预防PCV1及PCV2的感染与传播，可达到很好的免疫效果，而不产生致病性，并体现出很强的特异性，以克服现有技术的不足。 

本发明是这样实现的：基于猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法，包括如下步骤 

1）将猪圆环病毒Ⅱ型ORF1基因进行PCR扩增，猪圆环病毒Ⅱ型ORF1基因具有如序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，扩增条件为：  PCR体系总体积50μL，其中ddH₂O为37μL，10×PCR Buffer 5μL，dNTP 1.0μL，上下游引物各1.0μL，DNA模板4.0 μL，Taq酶1.0 μL；扩增程序为：94℃ 预变性3min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1.5min，共进行30个循环；最后延伸72℃ 10min；上游引物的序列为Primer F 5′-CGGGTACCATGCCCAGCAAGAAGAATG-3′，下游引物的序列为PrimerR 5′-GGCCCGGGTCAGTAATTTATTTCATATGGAA-3′；

2）将扩展获得的PCR产物与pMD18-T载体连接，将连接产物转化入大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞，在37℃下培养12 h，挑取上述白色菌落，接种到含有氨苄青霉素的2×YT液体培养基中，在37℃振荡培养过夜至混浊，提取质粒并进行酶切鉴定；

3）将重组质粒pMD18-ORF1与pEGFP-C1载体分别进行KpnI和XmaI双酶切，回收纯化目的片段，将二者用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，连接产物转化至大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞，用试剂盒提取质粒并进行KpnI和XmaI双酶切，用试剂盒提取获得阳性重组质粒pEGFP-C1- PCV2- ORF1，并进行双酶切及PCR鉴定；

4）真核构建体系为：目的DNA片段8μL、pEGFP-C1 2μL、T4 DNA ligase0.5μL、10×T4 DNA ligase buffer 1.5μL、灭菌ddH₂O 3.0 μL，总体积15.0 μL；