[发明专利]表达高效木聚糖酶重组质粒及重组毕赤酵母菌的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域及半纤维素分解领域，具体涉及一种表达高效木聚糖酶重组质粒及重组毕赤酵母菌的构建方法。

背景技术

植物中含有20％～30％的半纤维素，木聚糖(xylan)是半纤维素的主要组分，在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素，约占细胞干重的35％。木聚糖在自然条件下很难被降解利用，通过酸水解或酶水解可将木聚糖转化成寡木糖和单糖，酸水解速度快，但伴随有毒性化合物产生，对随后的微生物发酵过程有影响，而酶水解条件温和，无毒性副产物产生。因此，发展高效的酶水解法处理纤维素废料有着广阔的应用前景。但当前有许多因素制约着其应用和发展，木聚糖酶酶活性不高，产酶效率不高，酶学性质达不到工业应用的要求，这些都成为木聚糖推广应用的制约因素。如何通过基因工程等技术获得产酶高，酶学性质优良，适合工业应用的木聚糖酶是当前亟待解决的问题。

由于木聚糖酶有广泛的应用价值，国内外有很多研究者致力于木聚糖酶的开发研究。研究集中在天然优良菌株的筛选和驯化，木聚糖酶的分离纯化及性质分析，优化培养条件等多个领域。同时微生物产生的木聚糖酶系复杂，活性较低，分离纯化增加了工业的成本。通过基因重组表达，可以获得单一酶。木聚糖酶分子生物学方面的研究虽然起步较晚，但发展迅猛。木聚糖酶基因是Bernier等在1983年从Bacillus Subrilis中最先分离得到的。自从80年代开始研究木聚糖酶的基因以来，至今已经克隆出一百余种不同微生物来源的菌株的木聚糖酶基因，并且在大肠杆菌及酵母等各种宿主菌中达到了活性表达。目前已发现的木聚糖酶基因有xynA，xynB，xynC，xynV，xynZ等。

木聚糖酶的研究方向：一方面是对木聚糖酶进行基因改造，改善其酶学性质，使之更适合工业应用要求。另一方面是研究如何提高木聚糖的表达水平，以期在工业生产中推广应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用双拷贝表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌及构建方法，本发明通过基因改造和表达产生高效木聚糖酶。

本发明的目的是通过如下方法实现的：一种表达高效木聚糖酶重组质粒，序列如序列表Seq ID No.1所示。

本发明还具有如下技术特征：

1、一种表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌的构建方法，构建过程包括如下步骤：

步骤(1)根据毕赤酵母密码子的偏好性，对木聚糖酶密码子进行优化；

步骤(2)pPICZαA-XynB-opt单拷贝表达载体的构建；

步骤(3)pPICZαA-(XynB-opt)₂双拷贝表达载体的构建；

步骤(4)重组质粒的电转化和表达。

2、如上所述的一种表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌的构建方法，所述步骤(2)pPICZαA-XynB-opt单拷贝表达载体的序列如序列表Seq ID No.2所示。

3、如上所述的一种表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌的构建方法，所述步骤(2)pPICZαA-XynB-opt单拷贝表达载体的构建的具体步骤如下：在优化合成的目的基因两端设计酶切位点，分别为EcoR I和Xba I，将该基因连接在pPICZαA载体上；将构建成功的重组表达载体pPICZαA-XynB-opt转化到大肠杆菌感受态E.coil top10中，在LB低盐培养平板上筛选阳性克隆。

4、如上所述的一种表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌的构建方法，所述步骤(3)pPICZαA-(XynB-opt)₂双拷贝重组质粒的构建的具体步骤如下：将pPICZαA-XynB-opt重组质粒分别用Bgl II单酶切，BamH I和Bgl II双酶切；然后进行酶切产物的回收后连接；并将连接产物转化入E.coil Top10感受态细胞，待长出可见菌落后，筛选出双拷贝重组质粒。

5、如上所述的一种表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌的构建方法，所述步骤(4)重组质粒的电转化和表达的具体步骤如下：将pPICZαA-XynB用Sac II内切酶单酶切使其线性化；同时，将单、双拷贝的重组质粒用限制性内切酶Bgl II单酶切分别使其线性化；经乙醇浓缩后，电转化入毕赤酵母GS115中，电转化条件为：2,000V，4-5ms；将重组菌涂布于含有100μg/mL Zeocin的YPDS平板上，28℃培养2-3天直至长出清晰菌落，筛选出高活性阳性克隆。