[发明专利]一种DNA构建物以及DNA体外拼接方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种用于遗传改造的构建物以及DNA体外拼接方法。

背景技术

DNA合成和组装技术的突破极大地推动了合成生物学领域的进展，而随着合成生物学的深入发展，对DNA合成和组装技术也提出了更多的挑战和要求。生物砖块标准化组装技术的出现，受到了合成生物学界的广泛应用和欢迎，极大简化了遗传回路构建过程中的思路设计和工作量。

合成生物学的核心概念“工程化、标准化、模块化”在生物砖块(BioBricks^TM)这个拼接标准上得到了很好的体现和传播。尤其是建立在生物砖块库基础上的IGEM国际竞赛不仅传播了合成生物学的思想，而且促进了合成生物学的开源共享，激发了青年学生对合成生物学的想象力。将DNA的生物功能元件进行表征后并建立标准化的接口形成的生物砖块，在构建基因回路的时候不仅技术操作上非常简便，更重要的是这种设计具备指数增长的组合潜能，不仅大大简化了基因回路构建中的设计和工作量，而且使得从简到繁构建越来越复杂的基因回路成为可能。相比于传统的克隆构建过程，生物砖块的组合潜能和层级组装策略受到了合成生物学界的广泛欢迎，降低了基因回路构建的技术门槛，使得越来越多的复杂设计不断涌现。

鉴于生物砖块组装技术的重要性，很多生物砖块组装技术的变种也陆续开发出来了，满足不同组装标准要求的文库构建工作也在开展。这些技术各有特点，最常用的生物砖块组装技术因为具有最长的开发时间和广泛的影响力，积累了最丰富的生物砖块文库(Shetty,Endyetal.2008；Kelly,Rubinetal.2009)。例如，BglBrick生物砖块组装技术因为接口选择的疤痕更合理，在融合蛋白的组装上更有优势(Lee,Krupaetal.2011)。最近，随着复杂基因回路构建的兴起，更多组装技术被开发出来。基于typeIIS限制性内切酶的生物砖块组装技术在开发和推广的过程中(Sarrion-Perdigones,Falconietal.2011；Weber,Engleretal.2011)。基于末端同源片段来进行组装的In-Fusion技术，Gibson技术也运用到生物砖块的组装中了(Sleight,Bartleyetal.2010；Siuti,Yazbeketal.2013；SleightandSauro2013)。针对复杂基因回路经常需要进行调试，能够进行拼接后修饰的Bioscaffold和迭代组装技术也被开发出来(Norville,Derdaetal.2010；Litcofsky,Afeyanetal.2012)。

目前，生物砖块的组装技术还有一些不足之处和很大的改进空间。例如，生物砖块组装过程中需要循环利用选定好的II型同尾限制性内切酶，这就要求在构建生物砖块标准化接口的时候去除生物砖块内部的酶切位点。目前主要是通过从头合成DNA的时候通过密码子替换去除末端用来拼接的酶切位点或者通过PCR同义突变的方式来去除生物砖块内部的酶切位点。从头合成，不仅价格昂贵，速度慢，而且部分DNA序列经过改变之后有可能会影响该段DNA序列的功能；而通过PCR同义突变时，不仅工作量巨大(特别是针对一些较大的生物砖块)，而且也会对该段DNA的功能带来不确定的影响。同时，这种要求限制了生物砖块组装技术的通用性，使得一些实验室自有的生物功能元件在没有去除内部酶切位点之前，不能通过标准化的接口技术来进行层级组装。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DNA构建物及其应用。

本发明的另一目的是提供一种体外拼接DNA的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种DNA构建物，所述DNA构建物含有结构如式I所示的核酸序列：

Ha-C-HbI

式中，Ha为第一归位内切酶酶切位点；C为待拼接的核酸序列；Hb为第二归位内切酶酶切位点；

其中，所述第一归位内切酶和所述第二归位内切酶为不同种类的同尾归位内切酶。

在另一优选例中，所述归位内切酶(Homingendonuclease)选自：I-SceI和PI-PspI。

在另一优选例中，所述式I中所述Ha为I-SceI酶切位点；所述Hb为PI-PspI酶切位点。

在另一优选例中，所述式I中所述Ha为PI-PspI酶切位点；所述Hb为I-SceI酶切位点。

在另一优选例中，所述的待拼接的核酸序列包括CDS序列、编码基因序列、抗生素生物合成基因簇、负责接合转移转移的元件或有特定功能的DNA序列。