[发明专利]一种检测海德尔堡沙门氏菌靶基因、PCR引物对及应用

说明书

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种检测海德尔堡沙门氏菌的特异性靶基因、PCR引物对、利用该引物对和靶基因进行检测的方法以及包括引物对和特异性靶基因的试剂盒和该引物对、靶基因在检测海德尔堡沙门氏菌试剂盒和检测上述沙门氏菌的应用。

背景技术

海德尔堡沙门氏菌(Salmonella paratyphi C)是引起人类感染的主要沙门氏菌血清型之一，此血清型菌株的主要宿主为人类。被感染者会出现不同程度的恶性、呕吐、腹泻和发热，严重者会出现败血症等。在最近的研究报告中显示，海德尔堡沙门氏菌会通过某些食物经口腔侵染到健康人体，从而引起以上各方面的症状。如Maria Hoffmann,Yan Luo等在《Genome announcements》2013年1月4-12页发表的题为《Genome sequences of Salmonella enterica serovar Heidelberg isolates isolated in the United States from a multistate outbreak of human Salmonella infections》中所述，海德尔堡沙门氏菌在北美是主要流行的一种沙门氏菌血清型。同时，国家质量监督检验检疫总局的2002年第25和26号令中明确规定沙门氏菌为必检项目。目前，海德尔堡沙门氏菌检测主要使用传统的培养方法，整个检测过程步骤较多，时间较长，一般需要4-6个工作日，而且干扰的因素较多，检测结果的判定较复杂，给食品检测带来非常不利的影响。

目前，随着分子生物学的不断发展尤其是聚合酶链式反应(PCR)的发展，通过分子技术检测鉴定沙门氏菌血清型变得更加可靠。用于海德尔堡沙门氏菌的PCR检测的靶基因研究较少且主要是依赖于国外学者的研究，如Hong,Y.,Liu,T等在《BMC microbiology》2008年8月178页发表的题为《Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis,Hadar,Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles.》中所述，利用O抗原和H抗原的等位基因设计引物进行海德尔堡沙门氏菌的PCR检测。但通过进一步分析，该基因靶点的特异性很难满足的实际样品的检测，此证明以其作为海德尔堡沙门氏菌的检测靶点很可能出现假阳性的现象，以上述基因作为靶基因，会造成检测结果不准确。

发明内容

本发明的目的是通过比较基因组分析获得海德尔堡沙门氏菌的特异性检测靶基因，从而通过特异性引物对进行PCR扩增、电泳检测该目的基因，解决了检测结果不准确，检测过程复杂，检测周期长的问题，实现了海德尔堡沙门氏菌高特异性快速检测的目的。

本发明提供一种用于检测海德尔堡沙门氏菌的特异性靶基因，SeHAC_2639基因，碱基序列如SEQ ID NO.1所示

本发明提供一种用于检测海德尔堡沙门氏菌的PCR引物对，该引物对序列为：上游：SEQ ID NO.2；下游：SEQ ID NO.3。

本发明还提供一种检测海德尔堡沙门氏菌的方法，包括以下步骤：

(1)提取样品DNA，PCR扩增；(2)凝胶电泳检测扩增产物(3)比较电泳后条带，如果在788bp位置有条带，则证明样品中含有海德尔堡沙门氏菌。

本发明提供的检测海德尔堡沙门氏菌的方法，电泳后788bp位置分离出的DNA片段大小为788bp的特异性片段，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供的检测海德尔堡沙门氏菌的方法，作为优选，PCR检测体系，25ul包含有：2×Master12.5ul，5uM引物对1ul，模板取1-5ul，补ddH₂O至25ul。

本发明提供的检测海德尔堡沙门氏菌的方法，作为优选，凝胶电泳采用琼脂糖凝胶电泳。

本发明提供的检测海德尔堡沙门氏菌的方法，作为优选，以1ul模板量加入25ulPCR反应体系计量，需要海德尔堡沙门氏菌DNA浓度为14pg/ul。此浓度为本发明方法PCR检测灵敏度。

本发明还提供一种用于检测海德尔堡沙门氏菌PCR试剂盒，该试剂盒包括上述的PCR引物对，即pHAm1-f、pHAm1-r。