[发明专利]猪肉质性状相关GLP2R基因片段的分子克隆及应用

说明书

技术领域

本发明属于家畜分子生物学技术领域，具体涉及一种包含如SEQ ID NO：1所示猪基因核苷酸的核酸分子。本发明还涉及如SEQ ID NO：1所示的GLP2R基因的分子克隆方法及多核苷酸序列中的单核苷酸多态性位点以及检测所述单核苷酸多态性位点的方法。

背景技术

猪肉是动物性蛋白的主要来源，随着人们对肉需要量的增加，对肉质的要求也相应提高。影响猪肉质的因素有遗传和非遗传的，猪肌内脂肪含量对肉质性状有很大的影响，一般来说，肌内脂肪含量越高，猪肉质越嫩，从而肉质越好。肉质性状大多属于数量性状，由微效多基因控制。许多肉质性状只能在动物屠宰后才能测定，所以常规选育只能进行同胞或半同胞测定，这样必加大选育成本，且遗传进展缓慢。猪基因组草图的构建，使得寻找影响肉质性状的主基因或与其紧连锁的分子标记成为可能，这些分子标记一经确认，就可进行标记辅助选择育种。利用分子标记进行辅助选择(MAS)进行肉质性状改良是一种有效的途径。

胰高血糖素样肽2(Glucagon-like peptide-2，GLP2)是近年来发现的一种肠上皮特异生长因子，有助于肠道生长发育，能促进修复肠道粘膜的病理损伤，提高肠屏障功能，抑制肠细胞凋亡，加快肠腔营养物质的转运，增强肠道对营养物质的吸收。此外，有报道指出，血清中GLP-2含量与2型糖尿相关。

胰高血糖素样肽2受体(Glucagon-like peptide-2recepter，GLP2R)属于G蛋白偶联受体家族，与胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1，GLP1)、胰高血糖素(Glucagon，GCG)和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(Glucose-dependent insulinotropic polypeptide，GIP)的受体高度同源。GLP2R作为GLP2的特异性受体，GLP2与其结合调节肠粘膜细胞增殖、分化和修复等。此外，Luo等(2012)以大白猪和东北民猪构建F₂代资源家系，F₂代有455头猪，所用基因芯片为PorcineSNP60K，测定了背最长肌的肌内脂肪含量、大理石纹、肉色等，全基因组关联分析(Genome-Wide of Analysis of Study,GWAS)研究表明，猪的GLP2R基因与肌内脂肪含量显著相关。GLP2R位于猪12号染色体、小鼠11号染色体、人17号染色体。目前，GLP2R已经在大鼠、人和小鼠等中克隆表达出来，但是，国内外对猪GLP2R基因的研究鲜见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种猪肉质性状相关的GLP2R基因片段的分子克隆及应用，通过克隆猪GLP2R基因cDNA分子，寻找GLP2R基因的突变位点，并检测GLP2R基因的多态性，为猪肉质性状标记辅助选择提供有用的分子标记。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种与猪肉质性状相关的GLP2R基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述，该SEQ ID NO：1序列的243bp处有1个G/A的碱基突变，导致PCR-RFLP-BstEⅡ多态性。

本发明以人的GLP2R基因序列(GenBank收录号为NM_004246.1)为种子序列，在GenBank中利用BLASTN(Basic Local Alignment Search Tool Nucleotide)，参照其同源性在80％以上的猪EST(Expression Sequence Tags)设计特异引物，利用RACE(Rapid Amplification of cDNA End)，克隆出猪GLP2R基因cDNA全长，该猪GLP2R基因的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，见图3。GLP2R基因的多态性是利用比较基因组学方法根据人的GLP2R基因序列设计引物，正向引物为5′-CGGGAACTCCTGTTGTGC-3′，反向引物为5′-TGAAGCGGTGAGAATGGTA-3′；再以猪的基因组DNA为模板扩增，扩增片段利用测序筛选SNP，并利用PCR-RFLP进行基因分型技术，发现第244bp处有一个A/G的碱基突变，导致PCR-RFLP-BstEⅡ多态性，经分析A/G位点存在3种基因型，AA基因型(746bp)、AG型(746bp、506bp、240bp)和GG型(506bp、240bp)。

可利用上述制备的猪分子标记检测外来猪种和中国地方品种，为标记辅助选择(MAS)奠定坚实的基础，提高了养猪生产经济效益，为指导猪的育种实践提供理论依据。