[发明专利]检测拟南芥叶片细胞数目的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种精确、客观地检测拟南芥叶片细胞数目的方法。

背景技术

目前，统计植物叶片细胞数目主要通过细胞计数板观察，在同等的样品处理条件下，酶解时间难于控制，酶解时间过短将导致细胞分离不完全，粘连体多，而酶解时间过长，原生质体容易破裂，获得的完整细胞比例不高，导致统计误差大。在取样计数时，原生质体在酶液中分布不均匀，使得计数时重复性不高，主观性强。

发明内容

本发明的目的是提供一种精确、客观地检测拟南芥叶片细胞数目的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种检测拟南芥叶片细胞数目的方法，包括以下步骤：

1)植物叶片的酶解：取1片拟南芥叶片，剪切成长0.5-1.0mm、宽0.1-0.2mm的小块，然后加入叶片酶解液0.5-1mL，于20-22℃，30-40rpm黑暗酶解10-12小时，至叶片酶解完全；

2)细胞裂解与细胞核的收集：

将酶解完全的叶片酶解液过300-400目筛，然后以1400g-1500g离心10-12min，弃上清，加入溶液I溶解沉淀，将剪去顶端的枪头安装于移液枪上吹吸沉淀数次，直至沉淀完全溶解；然后将溶液于1400g-1500g离心10-12min，弃上清，向沉淀中加入预冷的细胞裂解缓冲液，再次将剪去顶端的枪头安装于移液枪上吹吸沉淀数次，直至混匀，冰浴5-10min后，4℃1400g-1500g离心10-12min，弃上清，所得沉淀再次用预冷的细胞裂解缓冲液溶解，并重复上述步骤1-3次，直至沉淀呈灰黑色；

3)细胞核的染色与计数：

向上述呈灰黑色的沉淀中加入细胞裂解缓冲液，将剪去顶端的枪头安装于移液枪上吹吸沉淀数次，直至沉淀完全溶解，然后加入等体积的染液II，混匀，冰浴30-40min后，用孔径300-400目的尼龙膜过滤，用流式细胞仪检测滤液中细胞核数目，从而获得叶片细胞数目。

其中，步骤1)中所述叶片酶解液的配方为：1.5％纤维素酶、0.4％离析酶、20mM KCl、pH5.7的20mM MES、0.4M甘露醇、10mMCaCl₂、5mMβ-巯基乙醇和0.1％BSA，以水配制；

步骤2)中溶液I的配方为：pH5.8的0.03％MES、154mM NaCl、125mM CaCl₂、5mM KCl和5mM葡萄糖，以水配制；

步骤2)和3)中所述细胞裂解缓冲液的配方为：15mM Tris、2mMNa₂EDTA、0.5mM四盐酸精胺、80mM KCl、20mM NaCl、0.5％TritonX-100和15mMβ-巯基乙醇，pH7.5，以水配制；

步骤3)中所述染液II的配方为：100μg/mL PI、100μg/mL RNase和0.1％TritonX-100，以磷酸缓冲液配制；所述磷酸缓冲液的配制方法为：取7.65g NaCl、0.725g Na₂HPO₄和0.212g KH₂PO₄，加入800mL水，调pH至7.4，然后定容至1L。

步骤1)中所述叶片酶解液的配制方法为：按比例称取纤维素酶、离析酶、KCl和甘露醇，加水溶解，然后向其中加入预先于70℃预热5min的MES，于55℃水浴加热10min，然后冷却至室温，加入CaCl₂、β-巯基乙醇和BSA，混匀，即得。

优选地，本发明的检测拟南芥叶片细胞数目的方法包括以下步骤：

1)植物叶片的酶解：取1片拟南芥叶片，剪切成长0.5-1.0mm、宽0.1-0.2mm的小块，然后加入叶片酶解液1mL，于22℃，30-40rpm黑暗酶解12小时，至叶片酶解完全；

2)细胞裂解与细胞核的收集：

将酶解完全的叶片酶解液过400目筛，然后以1500g离心10min，弃上清，加入溶液I溶解沉淀，将剪去顶端的枪头安装于移液枪上吹吸沉淀数次，直至沉淀完全溶解；然后将溶液于1500g离心10min，弃上清，向沉淀中加入预冷的细胞裂解缓冲液，再次将剪去顶端的枪头安装于移液枪上吹吸沉淀数次，直至混匀，冰浴5-10min后，4℃1500g离心10min，弃上清，所得沉淀再次用预冷的细胞裂解缓冲液溶解，并重复上述步骤1-3次，直至沉淀呈灰黑色；

3)细胞核的染色与计数：