[发明专利]水稻中胚轴伸长基因qML3的分子标记与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种水稻中胚轴伸长基因qML3的分子标记与应用，属于水稻育种中的检测技术领域。

背景技术

胚轴是构成种子和幼苗及其形态建成过程中的重要部分，它连接着胚根、胚芽、子叶和禾本科植物的胚芽鞘，通常分为上胚轴(子叶节或胚芽鞘节至胚芽的一段)、中胚轴(禾本科植物盾片节至胚芽鞘节的一段)和下胚轴(子叶节或禾本科的盾片节至胚根的一段)。在水稻中，上胚轴基本不活动，下胚轴的伸长也极其有限，主要靠中胚轴的伸长将胚芽连同伸长的胚芽鞘送至土表附近，以便幼苗吸收空气中氧气而进行随后的正常生长。所以，水稻中胚轴的伸长对直播水稻萌发后的幼苗生长至关重要，选育具有中胚轴伸长特性的品种是直播技术推广的重要前提。关于长中胚轴水稻资源的筛选已有部分报道。林建荣等研究表明，中胚轴伸长特性受2对隐性基因控制，并与株高存在一定的连锁关系。随着以分子标记连锁图谱为基础的QTL分析技术的发展，该技术已成为研究复杂性状遗传机理的主要手段之一。

发明内容

本发明解决的技术问题是设计和开发位于qML3两侧的特异性分子标记，将这个分子标记命名为qML3-1和qML3-2，所述片段如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。具体地，本发明设计开发的分子标记的核苷酸序列如下：qML3-1的上游引物序列为：5，-CCTATCCCATTAGCCAAACATTGC-3’；qML3-1的下游引物序列为：5’-GATTTACCTCGACGCCAACCTG-3’；qML3-2的上游引物序列为：5’-ATGAGATGAGTTCAAGGCCC-3’；qML3-2的下游引物序列为：5’-AACTCTGTACCTCCATCGCC-3’。

本发明采用以下技术方案：根据前期定位结果，分别测定了丽江新团黑谷和沈农265的目标区域，并进行了比对分析，挑选出一对微卫星差异，并设计出该标记。将此标记应用于丽江新团黑谷和沈农265进行验证，发现具有qML3的沈农265在利用qML3-1检测时，能够扩增出190bp左右的条带，而丽江新团黑谷能够扩增出200bp左右的条带。在利用qML3-2检测时，沈农265能够扩增出210bp左右的条带，而丽江新团黑谷能够扩增出200bp左右的条带。并进一步对重组自交系进行验证，发现这两个该分子标记与qML3共分离。综上，此分子标记可以用于鉴定待测材料是否在qML3座位上含有沈农265的中胚轴的增效等位基因。

一种水稻中胚轴伸长基因qML3的分子标记与应用，应用下述步骤检测待测材料是否在qML3座位上含有沈农265的中胚轴增效等位基因，具体过程为：

(1)DNA提取，具体过程为：

(1a)取长至10cm左右黄化苗4-5株剪碎，放于研钵中并立即加入液氮研磨成粉末，置于1.5ml的微量离心管(EP)中。

(1b)加入预热至65℃的CTAB抽提液[2％(w/v)CTAB；100mmol/LTris-Hcl，pH8.0；20mmol/LEDTA，pH8.0；1.4mol/LNaCl]600μL。

(1c)轻轻混匀，使粉末充分散开，呈悬浮状态，放于60℃的水浴30-60min，期间每5min轻轻倒转离心管使之分散均匀。

(1d)取出后，待冷至室温后加入等体积的氯仿：异戊醇(24∶1)，室温振荡，充分混匀，然后于台式冷冻离心机上10000rpm离心10min，取上清液转入另一离心管中。

(1e)重复3-4次，直至中间没有蛋白层为止。

(1f)将上清液逐滴加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇中，-20℃放置30min以上。

(1g)此时可见DNA成棉絮状小团漂于液面，用玻璃钩勾出，以灭菌的滤纸条吸去残液，在超净工作台上吹干。

(1h)用100μL的TE缓冲液(10mmol/LTris-Hcl；1mmol/LEDTA，pH8.0)回溶待用。

(1i)取1.5μL用于PCR扩增。