[发明专利]CYP119‑T213G/T214V突变酶及其用途

说明书

技术领域

本发明属于酶学领域，具体涉及一种CYP119酶的突变酶及其用途。

背景技术

对映异构体为分子量和结构完全相同，但行驶功能完全不同的两种化合物，然而，对于对映异构体的拆分非常困难。催化剂的对映选择性即体现了其催化底物生成单一对映异构体的能力，因此，对应选择性的提高，有利于获得单一对映异构体。提高酶的对映选择性为获得单一手性化合物具有重要意义。CYP119酶(cytochrome P450119)来自黄石公园火山口分离的嗜酸嗜热硫矿硫叶菌(Sulfolobus solfataricus)，因此该酶具耐酸抗高温等作用。研究表明CYP119酶能催化月桂酸和苯乙烯等底物发生环氧化反应，该反应绿色环保具有较高应用前景。由于该酶的天然底物未能确定，因此，利用苯乙烯作为CYP119酶的底物进行环氧化反应时，获得的对映选择性不高。Ortiz de Montellano小组^[1,2]报道，CYP119野生型酶在常温下催化苯乙烯环氧化反应的过氧化氢酶途径中，S和R构型的环氧苯乙烷之比约为3:1。其突变体T214V在过氧化氢途径下的苯乙烯环氧化反应速率比野生型有所提高，但其对映选择性与野生型相比几乎无变化。后来Rabe KS等^[3]，考察了CYP119酶催化苯乙烯环氧化反应的最佳温度和PH值，结果表明，温度为70℃，TBHP为辅助氧化剂，pH8.5的甘氨酸缓冲液为野生型CYP119酶催化苯乙烯环氧化反应的最佳反应条件,但是随着温度的升高，其对映选择性降低。在70℃时，CYP119酶催化苯乙烯环氧化反应产物S和R构型的环氧苯乙烷之比降低为2:1。故本领域急需要解决其对映选择性不高的难题。

[1]Koo L.S.,Tschirret-Guth R.A.,Straub W.E.,et al.J.Biol.Chem.2000,275,14112–14123.

[2]Koo L.S.,Ortiz de Montellano.J.Biol.Chem.,2002,124,5684-5691.

[3]Rabe KS,Kiko K,Niemeyer CM.Chemical biology chemical.2008,9,420-425

发明内容

本发明要解决的技术问题是现有的CYP119酶的对映选择性不高的问题。本发明解决该技术问题的技术方案是提供了一种野生型CYP119酶的双突变体。

该CYP119酶的双突变体的突变方式为T213G和T214V。

进一步的，上述的CYP119酶的双突变体的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了上述CYP119酶的双突变体的编码基因。

进一步的，上述CYP119酶的双突变体的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

本发明也还提供了含有上述编码基因的载体。

同时，本发明提供了上述载体的宿主细胞。

此外，本发明提供了上述CYP119酶的双突变体在制备环氧化反应催化剂中的用途。

其中，上述的环氧化反应的底物为月桂酸或苯乙烯。也可以是月桂酸或苯乙烯的类似物或衍生物。

本发明的有益效果在于：本发明创造性地提供了一种CYP119酶的213G和214V的双突变体，该双突变体在常温和高温下均能有效催化苯乙烯环氧化反应，同时能获得较野生型酶明显更高的对映选择性。具有很好的应用前景。

附图说明

图1、苯乙烯及R-，S-环氧苯乙烷标准品GC-MS图谱，此图反映了底物苯乙烯和环氧化产物的保留时间。

图2、双突变酶在35℃下催化苯乙烯环氧化反应的结果，此图表明了在35℃下，苯乙烯环氧化反应生成的两个对映异构体产物的积分面积比值，从而可计算得出其对映选择性数据。

图3、双突变酶在70℃下催化苯乙烯环氧化反应的结果，此图表明了在70℃下，苯乙烯环氧化反应生成的两个对映异构体产物的积分面积比值，从而可计算得出其对映选择性数据。

图4环氧苯乙烷离子碎片峰，具有了了环氧苯乙烷的特征离子峰，表明检测产物存在。

具体实施方式