[发明专利]一株布鲁氏菌弱毒株及其疫苗

说明书

技术领域 本发明涉及一株布鲁氏菌弱毒株及其疫苗。该疫苗为牛、羊和猪对布鲁氏菌病的预防用活疫苗，属兽用生物制品领域。

技术背景

布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌或称布鲁氏菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。本病不但对动物的繁殖和生产性能具有严重危害，更重要的是，人感染布鲁氏菌后，往往难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。因此在布鲁氏菌流行的国家，消除布病一直是公共卫生计划中最重要的目标之一。目前全世界范围内消除该病的主要方法是扑杀与免疫相结合，对布病发生相对比较严重的中国，由于扑杀的成本高，疫苗预防成为本病主要控制手段。

根据布鲁氏菌表型的差异，可将布鲁氏菌分为光滑型(S)和粗糙型(R)两类，目前在我国使用的布病活疫苗均为光滑型菌株，其免疫带来的主要问题是使用后无法区分疫苗免疫与自然感染的动物，这在很大程度上限制了布鲁氏菌疫苗的使用和推广，也给布病的有效防治和清除带来了一定的难度。

虽然布鲁氏菌存在两种不同的表型，在凝集类抗体水平上无交叉反应，但却具有良好的交叉保护性，并且不同种来源的布鲁氏菌相互之间同样存在交叉保护能力。如果用粗糙型布鲁氏菌疫苗免疫的动物，其血清只与粗糙型抗原发生凝集反应，而与光滑型血清不反应，以此可以区分疫苗生产用菌株和野毒株。基于上述原因，人们对粗糙型布鲁氏菌疫苗株的研发从未间断过。到目前为止，成功开发出具有良好免疫原性的粗糙型布鲁氏菌疫苗株却鲜有报道。

最早使用过的粗糙型布鲁氏菌疫苗是用45/20菌株制备的，但该菌株极不稳定，经常会出现从R型到S型的变异，造成毒力返强，因而该疫苗已基本不再使用。90年代美国科学家通过利福平诱变获得了粗糙型布鲁氏菌RB51菌株，该菌株具有良好的免疫力，已在美国和拉美的多个国家广泛使用。但其安全性仍有争议。

已有的研究证实布鲁氏菌细胞壁脂多糖(LPS)中的O链组成决定了其光滑型或粗糙型的表型，O链的某些成分缺失，会导致菌株由光滑型变成粗糙型。现已发现多个与布鲁氏菌光滑型表型相关的基因，包括gmd、per、pgm、wbkA、lpx、wa、wbkC、wz和wbkC。但到目前为止，国内外尚无转基因获得的重组布鲁氏菌弱毒株及其疫苗被批准和应用。

发明内容

2007—2012年间，本实验室陆续从我国不同省份和地区牛、羊、犬和鹿等动物体内分离到牛种布鲁氏菌41株，羊种布鲁氏菌74株，犬种布鲁氏菌9株。研究过程中，我们初步发现了一株牛种布鲁氏菌(Brucellaabortus)分离株，其毒力介于强毒和疫苗毒之间，专利申请人已对其进行了全面的生化检定，并分别用小鼠和豚鼠测定了其毒力。结果发现其毒力介于强毒和弱毒之间，测定为中等毒力布鲁氏菌，命名为Abortus343。本发明本发明采用低浓度氯霉素(1μg/ml)与光滑型牛种布鲁氏菌抗血清(A因子血清)相结合的诱导方法，筛选获得了一株遗传稳定的粗糙型布鲁氏菌命名为RA343。RA343株安全性高，免疫效果好，用该菌制备的疫苗免疫动物后，其血清可用常规的凝集试验与自然感染相区分。

本发明的技术方案

1.一株牛种布鲁氏菌(Brucellaabortus)弱毒菌株RA343，其特征在于采用氯霉素与A因子血清相结合的筛选方法，筛选获得了一株不干扰布病临床诊断的粗糙型牛种布鲁氏菌，用该菌制备的疫苗免疫动物后，其血清可用常规的凝集试验与自然感染相区分，牛种布鲁氏菌(Brucella abortus)RA343菌株已于2014年05月20日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为：CGMCC No.8886。

2.一种布鲁氏菌活疫苗的生产方法，其特征在于用胰大豆肉汤作为布鲁氏菌CGMCC No.8886株的培养基；培养基灭菌后按培养基量的按1％～2％接入布鲁氏菌CGMCC No.8886株种子菌液，37℃，按常规方法发酵培养28～38h，加入兽用生物制品常用的冻干保护剂，充分混匀、分装疫苗瓶中后经冷冻真空干燥，即成为粗糙型RA343株牛种布鲁氏菌病疫苗。

本发明是通过以下步骤实现的：