[发明专利]一种结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及细菌培养与疫苗制备领域。具体涉及一种结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基的制备方法及使用该培养基快速鉴别结核分枝杆菌的方法、测定结核分枝杆菌对抗结核药的耐药性方法及使用该培养基中的液体培养基快速培养卡介苗的方法。 

背景技术

结核分枝杆菌俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌。可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病。估计世界人口中1/3感染结核分枝杆菌。据WHO报道，全世界约每3个人中就有1个人感染了结核分枝杆菌，在某些发展中国家成人中结核分枝杆菌携带率高达80%，其中约5%～10%携带者可发展为活动性结核病。目前全球每年约出现8百万结核新病例，并导致约3百万人死亡。中国每年死于结核病的人约25万之多，是各类传染病死亡人数总和的两倍多。通常对儿童采取接种卡介苗来预防结核病的发生，在临床上，只有快速鉴别出结核分枝杆菌，并对其进行培养，才能进一步找到对结核分枝杆菌有效的药物，因此要求提高结核分枝杆菌的鉴别速度，并且要尽量避免培养过程中存在的细菌污染问题。 

长期以来我国一直采用罗氏培养基进行培养，培养成功需1个月以上，目前的培养卡介苗（BCG）培养基与培养方法严重滞后。由于结核分枝杆菌的快速培养、鉴定以及卡介苗（BCG）的制备对于结核病的确诊和治疗及结核病的预防具有重要的作用，因此迫切需要进行快速培养BCG和结核分枝杆菌的培养基。 

结核分枝杆菌培养所用时间较长，原因是无论使用现在的固体培养基或液体培养基均不能及时给结核分枝杆菌提供生长所需营养物质，固体培养基的营养物质需不断扩散到表面，才能被结核分枝杆菌吸收，这样营养物质提供的速度决定了结核分枝杆菌增殖的速度；液体培养基在培养初期能较快的提供营养物质，但随着培养的进行，营养物质被不断消耗，从而影响结核分枝杆菌的增殖速度。 

发明内容

本发明的目的是提供一种结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基的制备方法及使用该培养基快速鉴别结核分支杆菌的方法、测定结核分枝杆菌对抗结核药的耐药性方法及使用该培养基中的液体培养基快速培养卡介苗的方法。本发明用于解决当前结核分枝杆菌培养鉴别时间长，疫苗生产时间长的问题。 

实现本发明上述目的所采用的技术方案为： 

一种结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基，培养基的制备方法如下：

（1）固体培养基的制备：

a. 称取盐酸吡哆醇1～5mg、谷氨酸钠180～220mg、氯化钙10～20mg、硫酸镁15～25mg、柠檬酸铁铵80～120mg、柠檬酸钠180～220mg、硫酸铵380～420mg、丙酮酸钠950～1050mg、氯化铜1～10mg、氯化锌1～10mg、天门冬素1950～2050mg、磷酸二氢钾15～25mg和磷酸二氢钠15～25mg溶于蒸馏水600～700ml中，121℃加热15～20分钟，冷却至20-25℃，得到固体培养基基础液；

b.称取中性甘油8ml、1%孔雀绿水溶液15ml和鸡卵液1000ml加入步骤a所得固体培养基基础液中，混合均匀，分装于无菌培养管内，每管7～10ml；

c.将b步骤所得无菌培养管于80～90℃加热10～20分钟，冷却，得到固体培养基，将固体培养基于4℃保存备用

（2）液体培养基的制备：

a.称取氯化钙1～10mg、硫酸镁5～15mg、油酸15～20mg、枸橼酸铁铵5～15mg、枸橼酸钠5～100mg、硫酸铵180～220mg、氯化铜1～10mg、氯化锌5～15mg、丙酮酸钠400～500mg、吐温-80 0.5～1ml、天门冬素950～1050mg、磷酸二氢钾950～1050mg和磷酸二氢钠1750～1850mg溶于蒸馏水450～600ml中，121℃加热15～20分钟，冷却至20-25℃，得到液体培养基基础液；

b.称取盐酸吡哆醇0.15g、甘油5ml、酵母浸液4ml、过氧化氢酶0.2g、生物素0.15g、聚氧乙烯硬脂酸酯0.6g、牛血清白蛋白200g、酪蛋白消化物2g和分枝杆菌培养上清液5ml加入马铃薯汁500ml中，混合均匀，过滤除菌，得到促生长因子混合液；

c.将步骤a所得液体培养基基础液与步骤b所得促生长因子混合液按体积比1：1混合均匀，得液体培养基混合液，向其中添加过滤除菌后的抑菌剂，得到液体培养基；其中抑菌剂为多粘菌素B，氨苄青霉素和两性霉素B，且三者的质量与液体培养基混合液的质量体积比均为0.1mg/ml；