[发明专利]截短的PCV2型衣壳蛋白ORF2病毒样颗粒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型衣壳蛋白基因及载体、菌株及其表达方法，和含该病毒样颗粒的疫苗及其在预防断奶仔猪多系统衰竭综合征(特别是PCV2)感染的用途。 

背景技术

猪圆环病毒2型PCV2属圆环病毒科，圆环病毒属，为无包膜的单链环状DNA病毒。此病毒在世界各国广泛流行，给世界养猪业造成了很大的经济损失。2型猪圆环病毒又包括两种亚型：PCV2a、PCV2b，近年来PCV2b在中国的流行范围最广，所占比例最大，而且PCV2b的毒性更强。 

PCV2ORF2蛋白为病毒的衣壳蛋白，分子量为25kDa，是PCV疫苗主要靶蛋白。在多种表达系统中表达的ORF2可形成在形态结构与天然病毒颗粒相似的病毒样颗粒(Virus-Like-Particle,VLP)。该病毒样颗粒为二十面体立体对称结构。其保留了病毒颗粒的天然表位，具有较强的免疫原性，可诱导针对圆环病毒的中和抗体。此外，病毒样颗粒并不带有病毒核酸，无潜在致癌危险，具有良好的安全性。因此，VLP疫苗已成为兽用疫苗发展的主要方向。随着分子生物学技术越来越多的应用于疫苗的研制。病毒样颗粒组装技术已经成功并广泛的运用于现代疫苗研发与生产。PCV2疫苗研制的关键是能够大量高效制备VLP颗粒。 

大肠杆菌表达系统是目前应用最为广泛的基因工程表达系统之一。由于该表达系统具有易于培养，不需要复杂设备，安全性高的显著特点，因此被广泛应用生物制药行业中。此前也有众多的研究者尝试利用大肠杆菌表达系统进行PCV2 ORF2蛋白的表达，进而进行PCV2预防性疫苗的开发。但是众多的研究结果均表明，ORF2蛋白N端含有由41个氨基酸组成的核定位信号，这个信号肽由于密码子偏嗜性的原因，致使ORF2蛋白在E.coli中的表达量非常低，失去了大规模商业应用的可能。 

发明内容

本发明提供一种基于大肠杆菌来源的、抗原表位的选择符合中国猪圆环病毒特征的PCV2型的N端截短衣壳蛋白PCV2 ORF2基因。基于本实验室的技术，通过序列优化，对PCV2衣壳蛋白原核表达进行研究，发现N端截短一直到27个氨基酸的衣壳蛋白依然能组装成病毒样颗粒。 

本发明要求保护的截短衣壳蛋白PCV2 ORF2基因具有如Seq ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9所示核苷酸序列。 

根据本发明的一个技术方案，该基因表达的蛋白能够在大肠杆菌内自组装成病毒样颗粒。 

本发明的第二方面，提供截短的PCV2 ORF2衣壳蛋白，具有如Seq ID No.10、11、12、13、14、15、16、17、18所示的序列。其中，基因序列Seq ID No.1对应于蛋白序列Seq ID No.10；基因序列Seq ID No.2对应于蛋白序列Seq ID No.11；基因序列Seq ID No.3对应于蛋白序列Seq ID No.12；基因序列Seq ID No.4对应于蛋白序列Seq ID No.13；基因序列Seq ID No.5对应于蛋白序列Seq ID No.14；基因序列Seq ID No.6对应于蛋白序列Seq ID No.15；基因序列Seq ID No.7对应于蛋白序列Seq ID No.16；基因序列Seq ID No.8对应于蛋白序列Seq ID No.17；基因序列Seq ID No.9对应于蛋白序列Seq ID No.18。 

本发明的第三方面，提供一种含有本发明截短的PCV2 ORF2基因的表达载体。 

根据本发明的一个技术方案，所述表达载体为适于在大肠杆菌中表达的载体。 

本发明的第四方面，提供一种含本发明截短的PCV2 ORF2基因的表达载体的细胞。 

本发明的第五方面，提供一种制备纯化截短的PCV2 ORF2基因表达的衣壳蛋白的方法，包括如下步骤： 

(1)在大肠杆菌表达系统中可溶表达截短的PCV2 ORF2基因， 

(2)将表达了截短的PCV2 ORF2衣壳蛋白的大肠杆菌破碎，分离得到上清液， 

(3)用含有氯化钾的硫酸铵分级分离，结合色谱层析纯化目的蛋白。