[发明专利]一种抗人甲状旁腺激素的纳米抗体及其筛选方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物化学与分子生物学领域，涉及一种抗人甲状旁腺激素(PTH)的纳米抗体及其应用。还涉及利用定点固载的方法包被抗原，从羊驼纳米抗体展示库中筛选出具有高活性的抗人PTH纳米抗体的方法。

背景技术

我国慢性肾脏病(CKD)患者逐年增加，至2014年初，发病率已增至11.5％左右，已成为影响人们生活质量的主要病症之一。当各种肾脏疾病或其他疾病引起的肾脏损伤发展到晚期就会进入慢性肾衰竭阶段，最后发展为尿毒症(Ong A C,et al.Kidney International,1994,45:345-351.)。尿毒症患者由于绝大部分肾实质破坏，肾功能几乎消失，导致多种代谢废物难以排泄和某些内分泌激素不能降解，在体内蓄积进而产生毒性，即尿毒症毒素。这些毒素可进一步导致代谢紊乱，多脏器损坏。甲状旁腺激素(PTH)就是最主要的尿毒症毒素之一。

PTH是甲状旁腺主细胞分泌的含84个氨基酸的碱性单链多肽类激素，分子量9425Da，等电点约为9.1，分子中不含半胱氨酸，亲水性氨基酸居多，二级结构中富含α-螺旋。PTH分子有较强的柔性，在不同溶剂中其结构有很大差别(Strickland L A,et al..Biochemistry,1993,32:6050-6057.)。

在正常人体内PTH的含量特别低，主要用于调节钙磷代谢。在肾衰竭患者体内，往往伴随有较高水平的PTH产生，高水平的PTH对人体多器官有害，是一种毒素。首先表现在损坏肾脏，PTH过高会造成肾脏及其他组织中的钙降低、磷沉积增加，从而损坏肾单位，直至肾功能消失；同时表现为对骨的破坏，PTH增加必然会促进溶骨作用以增加血钙含量，会造成肾性骨营养不良、骨痛骨折等；还会造成肾性贫血和心脏衰竭(Gruson D,et al.Clinica Chimica Acta,2014,doi:10.1016/j.cca.2014.03.029.)。据调查，维持性血液透析患者中很大一部分伴有继发性甲状旁腺功能亢进，严重影响患者的治疗和生活质量，因此寻找有效治疗甲状旁腺功能亢进去除过多的PTH的方法十分重要。

降低肾衰竭病人体内过多的PTH可以缓解肾衰病人病情恶化。目前临床上的治疗方法主要包括：药物治疗、血液净化治疗以及手术治疗。药物治疗用于初期或者辅助性治疗，而切除甲状旁腺的手术治疗副作用很大，所以血液净化治疗被认为是最有发展前景的治疗方法。目前研究的血液净化方式主要包括血液透析、血液灌流等。由于血液中有很多与PTH分子性质相似的蛋白，现有的非特异性配基的血液灌流对PTH去除能力差，还会存在大量非特异性吸附。因此开发一种新的吸附材料对推动血液净化方法的发展十分必要。PTH在血液中含量相对较低，肾衰竭患者PTH浓度1200±600ng/L，这种吸附材料需要具备较高的亲和性。

有些研究者将抗体技术引入临床，其在诊断、治疗方面表现出良好的发展前景。比如利用卵黄抗体吸附PTH，取得了很好的效果，但是由于卵黄抗体分子结构复杂，只能从卵黄蛋白中提取，得到特异性卵黄抗体的量很低，不利于大规模应用。

1993年，Hamers-casteman等发现骆驼血清中存在一种天然缺失轻链却具有完整功能的重链抗体(Hamers-Casterman C,et al.Nature,1993,363(3):446-448.)，说明重链抗体的重链可变区(VHH)能够单独形成完整的抗原结合位点，克隆该部分便得到了纳米抗体。纳米抗体分子量低，免疫原性弱，稳定性高，亲和力高，而且易表达，基于这些优势，纳米抗体成为去除PTH材料的最佳选择之一。