[发明专利]提高微生物转谷氨酰胺酶在大肠杆菌中可溶性表达的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种提高微生物转谷氨酰胺酶在大肠杆菌中可溶性表达的方法。

背景技术

微生物转谷氨酰胺酶(MTG)是一种催化多肽链中谷氨酰胺的γ-酰基转移至另一底物中氨基，形成γ-谷氨酰化合物的转移酶。目前，MTG已广泛应用于食品工业。转谷氨酰胺酶广泛存在于动物许多组织中，但由于含量低、分离困难、热稳定性差、对钙离子的依赖性，使之工业化生产十分困难。目前，MTG已广泛应用于食品工业。转谷氨酰胺酶广泛存在于动物许多组织中，但由于含量低、分离困难、热稳定性差、对钙离子的依赖性，使它的工业化生产十分困难。

大肠杆菌由于生长速度快，培养简单，价格低廉，遗传背景清楚等优点，其表达系统得到广泛应用。但是，该系统也存在不足，如表达的外源蛋白质常以不溶性无功能的包涵体形式存在。人们利用多种方法改善外源蛋白在大肠杆菌中的折叠，其中，共表达分子伴侣由于对蛋白的折叠较为有效，纯化的外源蛋白不需要除去融合标签等优点而备受关注。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高微生物转谷氨酰胺酶在大肠杆菌中可溶性表达的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种提高微生物转谷氨酰胺酶在大肠杆菌中可溶性表达的方法，其是将pET-MTG与pA-GESP两种质粒共转化大肠杆菌DE3(E.coli Rosetta)，诱导后的上清中，微生物转谷氨酰胺酶呈可溶性表达。通过与分子伴侣共表达，从而提高MTG在大肠杆菌中的可溶性表达。

前述的方法，诱导所使用的诱导剂为IPTG，IPTG的终浓度为0.4-0.6mmol/L，诱导温度为27-29℃，诱导时间为10-14h。

优选地，诱导所使用的IPTG的终浓度为0.4mmol/L，诱导温度为28℃，诱导时间为12h。

前述的方法，诱导后的上清中含有共表达产物微生物转谷氨酰胺酶以及大肠杆菌分子伴侣GroEL、GroES和GrpE，采用亲和层析法对共表达产物进行分离纯化。

本发明中涉及的微生物转谷氨酰胺酶(MTG)来自于茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)。

本发明中涉及的质粒pET-MTG的构建方法为

以1μg茂原链轮丝菌基因组DNA为PCR反应模板，设计引物1：5′-TAAAAACATATGGACTCCGACGACAGGGTCAC-3′和引物2：5′-TAAAAACTCGAGTTACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3′，进行PCR扩增，回收PCR扩增产物用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，回收酶切片段，与同样用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切的pET-22b载体连接(于16℃连接16h)，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒后进行双酶切分析验证，并进行DNA测序鉴定，插入序列正确的质粒命名为pET-MTG。

本发明中涉及的质粒pA-GESP的构建方法包括以下步骤：

(1)粘性末端PCR技术扩增含有分子伴侣的人工操纵子

根据扩增人工操纵子(GenBank ID：NC_010473.1)上、下游基因的序列，设计两对引物，引物3：5′-CATGGCAGCTAAAGACGTAAAATTC-3′和引物4：5′-GTTAAGCTTTTGCTTTCGCTACAGT-3′,以及引物5：5′-GCAGCTAAAGACGTAAAATTCGGTA-3′和引物6：5′-TCGAGTTAAGCTTTTGCTTTCGCTA-3′，分别用引物3和4、引物5和6，在两个管中同时进行PCR扩增，加入3μl的质粒大肠杆菌基因组DNA为模板，回收PCR扩增产物，测定A260值，将两个PCR产物等摩尔混匀，于94℃变性5min，37℃保温40min，取16μl反应产物，加入2μl的10×T4连接酶缓冲液，2μl的10U/μl T4多聚核苷酸激酶，37℃保温3h后，回收磷酸化的PCR产物；

(2)质粒pA-GESP的构建

将磷酸化的PCR产物用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切，回收酶切片段，与同样用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切的pACYC Duet-1质粒连接(于16℃连接16h)，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒后进行双酶切分析验证，即构建得到质粒pA-GESP。

步骤(1)中进行PCR扩增所采用的反应条件为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min，共30个循环。