[发明专利]一种罗汉果SgCS基因的突变体及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种来源于罗汉果的SgCS基因的突变体及其在生产罗汉果甜苷V中的用途。 

背景技术

罗汉果(Siraitia grosvenorii)中含有多种皂苷成分，目前已报道分离到了20多种罗汉果葫芦烷型四环三萜型皂苷成分，其中罗汉果苷IV、苷V和赛门苷I是迄今为止报道的罗汉果甜苷中甜度最高的3种成分，分别为蔗糖甜度的392，425和563倍。在所有甜苷中，罗汉果苷V的含量最高，约占总皂苷含量的20％；同时作为主要的活性成分，罗汉果苷V具有镇咳、祛痰，解痉活性，具有抗癌，抗炎，降血糖等作用，使之成为为数不多的从中药中发掘出来的具有治疗功能的新型甜味剂。罗汉果甜苷具有甜度高，热量低，无毒，口感好，没有甜菊苷的特殊苦味，2008年美国可口可乐公司新推出的饮料中添加了罗汉果苷V，2011年中国2家公司的罗汉果提取物也通过了通过美国FDA的GRAS认证，成功打入美国市场。但是由于市场上罗汉果苷提取物的价格居高不下，因此在食品、保健品、日用健康用品方面无法与蔗糖竞争。 

然而，罗汉果苷V的分布具有组织特异性，只存在成熟果实中，而且含量很低仅占果实干重的1％左右，占鲜果含量的3-4‰。常规杂交育种的手段来提高罗汉果苷V的含量难度大，周期长。首先，野生的罗汉果资源目前几乎灭绝，而栽培品种单一化严重，遗传背景狭窄(遗传相似系数在0.9以上)；其次，异花授粉的罗汉果从遗传角度来看是高度杂合的，近交后代性状衰退明显，培育纯合型的品系难度极大；第三，罗汉果的品质属于数量性状，受微效的多基因控制，如果将多个亲本上的优良性状集中于某一个品种的培育周期过长；再者，作为雌雄异株的罗汉果，其实生苗的后代雌雄比例约为3:7，利用目前的手段无法在开花前判定其性别分化，每株植株在种植时占地面积约为4.5cm²，大量组合高品质形状来筛选单株实生苗将极大浪费土地和资金；最后，采用多倍体育种的方法出现果实明显变小的问题。近年来，提高罗汉果苷含量的研究成为热门的研究方向。据统计，每提高1‰果实中罗汉果苷V含量可降低10％的提取成本。因此，我们认为从罗汉果苷V生物合成的相关酶入手，通过研究相关酶的基因功能，来调控解决罗汉果苷含量低的难题，将是一条更为直接、更加有效的新途径。 

现有的报道一定程度预测了罗汉果甜苷生物合成途径，首先经甲羟戊酸(MVA)和甲基赤藓糖醇磷酸化(MEP)两条途径形成异戊烯二磷酸(IPP)和3,3-二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，IPP和DAMPP之间可以相互转化，MVA途径发生在胞质中，MEP途径发生在质体中。这是三萜皂苷生物合成共有的途径，其中在MVA途径中的3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG-CoA reductase,HMGR)催化3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)生成甲羟戊酸(mevalonate,MVA)，这一步反应是需要依赖于NADP的不可逆转的过程，HMGR是该途径中的关键限速酶，可以受洛伐他汀的专一性抑制。IPP和DMAPP能够被牻牛儿基焦磷酸合酶(GPS)催化形成牻牛儿基焦磷酸(GPP)，IPP与GPP在法呢基焦磷酸合酶(FPS)的催化作用下进而形成法呢基焦磷酸酯(FPP)，然后再经角鲨烯合酶(squalene synthase,SQS)的催化形成角鲨烯(Squalene)，SQS是异戊二烯途径中的限速酶,是一类与膜结合的蛋白，是具有两种功能的酶，首先能够催化2分子的法尼基焦磷酸(FPP)缩合生成前角鲨烯二磷酸(presqualene diphosphate,PSPP)，接着在NADPH和Mg2+存在的情况下将PSPP转化成角鲨烯，作为植物中甾醇和三萜化合物的第一个前体。SQS是三萜类物质生物合成途径中的关键酶，其表达高低及活性强弱直接决定了下游产物的含量高低，目前已经在细菌、酵母、灵芝、动物、人类和植物中得到克隆分离。角鲨烯环氧化酶的继续作用形成2,3-氧化角鲨烯，该物质是植物甾醇和三萜皂苷合成的共同前体物质，氧化角鲨烯的环化一步决定了下游的走 向，是植物甾醇还是三萜皂苷。在罗汉果中，葫芦二烯醇合酶(cucurbitadienol synthase，CS)和环阿乔醇合酶(cycloartenol synthase，CAS)基因同属于角鲨烯环化酶基因家族，其中CS能够环化成葫芦二烯醇，经过一系列的加羟基、加糖基反应生成罗汉果苷，是甜苷合成中的关键一步；而CAS能够环化成环阿乔醇，在此基础上经过基部修饰得到植物甾醇，CAS是植物甾醇及甾体类化合物合成的第一个关键酶。