[发明专利]信使RNA帽的抗‑反向硫代磷酸类似物的合成和用途

说明书

本申请是申请日为2008年6月19日、申请号为200880102959.9、发明名称为“信使RNA帽的抗-反向硫代磷酸类似物的合成和用途”的发明专利申请的分案申请。

Jacek Jemielity,Ewa M.Grudzien-Nogalska,Joanna Kowalska,Edward Darzynkiewicz,和Robert E.Rhoads

文件编号：Jemielity07S01W

在美国中根据35U.S.C.§119(e)，和在所有国家中根据适用的条约和公约，要求2007年6月19日提交的临时美国申请系列号60/944,842的提交日期的权益。

本发明的开发部分地在由国家综合医学研究所(National Institute of General Medical Sciences)给予的基金号R01GM20818下得到美国政府的资助。美国政府享有本发明中的某些权利。

本发明的开发部分地在由波兰科学和高等教育部(Polish Ministry of Science and Higher Education)给予的基金号2P04A00628下得到波兰政府的资助。

技术领域

合成了新的信使RNA帽的抗-反向(anti-reverse)硫代磷酸类似物，并且显示在mRNA的翻译中是有用的。

技术背景

在真核细胞中，大多数信使RNA(mRNA)的5'末端被封闭，或“帽化(加帽)”。此外，还存在有一些也被帽化的其他形式的RNA， 例如核内小RNA(snRNA)。所述帽包含有在两个核苷部分之间的5'-5'三磷酸键合和远端鸟嘌呤环上的7-甲基。mRNA和snRNA的帽化促进其在细胞中的正常功能。

能够在体外合成加帽的RNA分子是有用的，因为这使得工作人员能够制备在各种生物学应用中表现适当的RNA分子。此类应用包括多肽的研究应用和商业生产，例如，在无细胞翻译体系中产生在特定位点包含“非天然”氨基酸的多肽，或在培养的细胞中产生就其活性或稳定性而言需要翻译后修饰的多肽。在后者体系中，合成进行显著更长的时间，并因此产生更多的蛋白质。

最经常用来在体外制备加帽的RNA的方法是，在所有四种核糖核苷三磷酸和帽二核苷酸例如m⁷G(5')ppp(5')G(此后，m⁷GpppG)存在下用细菌或噬菌体RNA聚合酶来转录DNA模板。聚合酶以下列方式来起始转录：m⁷GpppG的Guo部分的3'-OH对于下一个由模板所决定的核苷三磷酸上的α-磷酸发动亲核攻击，从而导致产生初始产物m⁷GpppGpN。通过在转录反应混合物中将m⁷GpppG与GTP的比率设定为在5和10之间来遏制备选的、由GTP起始的产物pppGpN。

合成RNA可以通过DNA模板的无细胞转录来合成。参见R.Contreras等人,“Simple,efficient in vitro synthesis of capped RNA useful for direct expression of cloned eukaryotic genes,”Nucl.Acids Res.,第10卷,第6353-6362页(1982)；J.Yisraeli等人,“Synthesis of long,capped transcripts in vitro by SP6and T7RNA polymerases,第42-50页,在J.Dahlberg等人(编辑),Meth.Enzymol.,第180卷,第42-50页(1989)中；和D.Melton等人,“Efficient in vitro synthesis of biologically active RNA and RNA hybridization probes from plasmids containing a bacteriophage SP6promoter,”Nucl.Acids Res.,第12卷,第7035-7056页(1984)。