[发明专利]单酶切载体的构建方法

权利要求书

1.一种单酶切载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)单酶切位点的筛选；

2)在目的基因两端引入酶切位点；

3)对载体和目的基因进行酶切和电泳切胶回收；

4)对目的基因和载体混合液进行温度梯度预处理；

5)使用连接T载体用的solution I连接载体与目的基因。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2)在目的基因的5’和3’端非编码区设计扩增引物，在上下游引物的5’端引入步骤1)确定的酶切位点，加上酶切位点相应的保护碱基，利用高保真酶扩增目的基因，扩增出5’和3’端含有相应的酶切位点的目的基因。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤4)载体与目的基因按物质量浓度1：10的比例加入。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤4)载体和目的基因混合液按以下程序处理：

80℃：3min；

55℃：15s；

45℃：15s；

16℃：30s；

在16℃30s结束后再加入solution I，在16℃下连接90min。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤4)连接反应总体系为15-20μL。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，目的基因与载体连接后，还包括如下步骤：

A、转化感受态细胞；

B、菌液涂板培养；

C、挑斑培养；

D、菌落PCR鉴定。