[发明专利]一种用全局转录机制工程构建有机溶剂耐受型大肠杆菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用全局转录机制工程构建有机溶剂耐受型大肠杆菌菌株的方法，属于生物工程技术领域。具体涉及对全局转录因子σ⁷⁰的编码基因rpoD进行随机突变并构建突变文库，筛选具有良好有机溶剂耐受性的σ⁷⁰突变株。

背景技术

大部分有机溶剂对微生物的生长都有毒害作用，通过破坏细胞质膜并影响其生长代谢最终导致细胞死亡。虽然微生物自身对有机溶剂有一定的耐受性，但一般耐受性比较弱，特别是对一些毒性较强的有机溶剂。因此，研究微生物有机溶剂耐受性机制，提高微生物对有机溶剂耐受性十分重要。目前的研究表明，微生物耐溶剂机制主要包括：细胞膜的有机溶剂外排泵，细胞质膜性质和结构的改变，胞内有机溶剂的降解及转化，胁迫反应机制。

全局转录机制工程是一种用来获得所需细胞表型的方法，通过对全局转录因子相关的编码基因进行突变，筛选得到所需的细胞表型。2006年，Gregory Stephanopoulos 等首次提出利用全局转录机制改变细胞表型，通过对细胞转录调控因子进行突变以扰动整个基因组的转录水平，从而改变细胞表型，提高大肠杆菌对乙醇的耐受性，代谢产物的积累等；通过突变spt15p因子，提高酵母细胞中葡萄糖向乙醇的转化率同时提高对乙醇的耐受性。此后，国内外研究者也利用全局转录调控机制的方法来获得理想的细胞表型。

发明内容

本发明的目的是通过突变全局转录因子σ⁷⁰，筛选得到能够提高大肠杆菌有机溶剂耐受性的突变菌株，为提高大肠杆菌有机溶剂耐受性提供一种有效方法。

本发明的技术方案：对pHACM质粒上的rpoD基因（编码σ⁷⁰因子）进行突变，将其转化大肠杆菌E. coli JM109，筛选得到能使大肠杆菌耐受69%（v/v）环己烷的σ⁷⁰突变基因rpoD^M1。

一种获得高有机溶剂耐受性菌株的定向改造方法，步骤为： 

（1）以携带野生型rpoD基因的pHACM质粒为模板进行随机突变，获得rpoD突变基因；

（2）以rpoD突变基因为引物，pHACM为模板，全质粒扩增构建σ⁷⁰基因突变库；

（3）转化大肠杆菌进行高通量筛选，以环己烷为有机溶剂压力，进行液体和琼脂平板交替筛选。

用所述方法获得的显著有机溶剂耐受性改善的σ⁷⁰突变基因rpoD^M1，其特点为： 

（1）该σ⁷⁰突变基因rpoD^M1携带三个突变位点，分别为Asp39Glu，Ala72Val和Thr94Met，其中123位突变产生终止密码子；

（2）携带该σ⁷⁰突变基因rpoD^M1的大肠杆菌E. coli JM109/pHACMC9能耐受69%（v/v）环己烷，而普通大肠杆菌在1%（v/v）环己烷条件下就停止生长。

所述的获得高有机溶剂耐受性菌株的定向改造方法，可适用各种微生物菌株的不同转录因子的定向改造。

以下是本发明技术方案的详细描述。

以重组质粒pHACM-rpoD（Alper H，Stephanopoulos G. Global transcription machinery engineering: a new approach for improving cellular phenotype[J]. Metabolic Engineering，2007，9: 258-267）为模板，构建rpoD基因的突变文库。将PCR扩增得到的rpoD突变基因为引物，pHACM-rpoD为模板全质粒扩增得到带有rpoD突变基因的重组质粒，经DpnI消化后转化E. coli JM109感受态细胞，涂布含30 μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜。洗脱单菌落，利用平板离心管交替筛选的模式，最后筛选得到显著提高大肠杆菌有机溶剂耐受性的rpoD^M1。