[发明专利]主动免疫治疗慢性哮喘的呈递IL-33的VLP疫苗构建方法

权利要求书

1.一种主动免疫治疗慢性哮喘的呈递IL-33的VLP疫苗构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1）、从小鼠提取IL-33总RNA，通过逆转录得到IL-33总cDNA，用设计的特异性引物将得到的总cDNA通过PCR扩增，得到编码IL-33成熟片段基因，所述特异性引物设计如下：

编码IL-33成熟片段基因的上游引物(5’端)：gtggatccagcatccaaggaacttcac

编码IL-33成熟片段基因的下游引物(3’端)：gtgaattcgattttcgagagcttaaac

2）、将编码截断的乙肝病毒核心抗原HBcAg克隆到pThioHisA载体，再将步骤1）得到的编码IL-33成熟片段基因插入到乙肝病毒核心抗原HBcAg的78-79位氨基酸之间，得到重组质粒pHBcAg33；

3）、将步骤2）得到的重组质粒pHBcAg33转化大肠杆菌DH5α或BL21感受态细胞上；

4）、用IPTG诱导步骤3）的转化有重组质粒pHBcAg33的大肠杆菌DH5α或BL21，高效表达IL-33目的蛋白，并用饱和度为40%和30%的硫酸铵、体积比为39%、33%和27%的碘克沙醇，对IL-33目的蛋白进行密度梯度离心纯化，最后用琼脂糖凝胶CL-4B柱子纯化IL-33目的蛋白，得到呈递IL-33的病毒样颗粒疫苗。

2.如权利要求1所述的主动免疫治疗慢性哮喘的呈递IL-33的VLP疫苗构建方法，其特征在于所述步骤2）的重组质粒构建如下：

编码截断的HBcAg基因由专业公司合成，其中5’端和3’端分别有BamH I 和 EcoR I的酶切位点，并用内切酶Nde I和Pst I酶切后克隆到pThioHisA中，得到质粒pHBcAg；然后再用BamH I 和 EcoR I将编码IL-33成熟片段基因的DNA插入到pHBcAg中，得到带有目的蛋白的重组质粒pHBcAg33。

3.如权利要求1所述的主动免疫治疗慢性哮喘的呈递IL-33的VLP疫苗构建方法，其特征在于所述步骤4）中的目的蛋白的诱导和纯化经过下列步骤：

1）将25℃下IPTG诱导4小时的1升菌液离心后，收集菌体；

2）用0.02 摩尔/升、pH 7.4的磷酸缓冲液20毫升，将步骤1）收集的菌体重新悬起来，用超声波破碎菌体后离心分离，收集上清20毫升；在收集的20毫升上清中加入4.86克硫酸铵，室温下放置30分钟后离心，收集沉淀，所述硫酸铵在25℃条件下达到的饱和度为40%；再用20毫升饱和度为30%的硫酸铵溶液洗涤收集的沉淀，共洗涤三次；最后用0.02 摩尔/升、pH 7.4的磷酸缓冲液溶解洗涤后的沉淀，每次用500微升溶解，共溶解4次；再通过体积比为27%、33%和39%的碘克沙醇进行密度梯度离心，具体操作为；从5毫升离心管的底部到顶部依次加入1.4毫升体积比为39%、33%和27%的碘克沙醇，加完后每个体积比的碘克沙醇之间形成明显界限，室温放置过夜；次日每个体积比的碘克沙醇之间的界限消失，向离心管中加入700微升磷酸缓冲液溶解样品，在16℃，50000转/分钟条件下，离心4小时；之后每200微升取一次样品，经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定后，将目的蛋白较多的样品用琼脂糖凝胶CL-4B柱子纯化，得到呈递IL-33病毒样颗粒疫苗。

4.如权利要求1所述的主动免疫治疗慢性哮喘的呈递IL-33的VLP疫苗构建方法，其特征在于所述步骤4）得到的呈递IL-33病毒样颗粒疫苗用于主动免疫治疗哮喘。