[发明专利]一种处理透射电镜无膜铜网片的方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于透射电子显微镜领域，涉及一种处理透射电镜无膜铜网片的方法及应用。

背景技术

超薄切片为现代生物学、医学的关键技术。生物电镜超薄切片样品的捞取采用网状材料做载物，通常称载网。常见的为无支持膜的铜网或有支持膜的两种。有支持膜（常为Formvar 膜）的由于支持膜有一定厚度，其样品反差较无支持膜的低，捞片过程中超薄切片容易产生皱褶，而且膜的制备过程较为复杂，制作要求比较高；但无支持膜的铜网与超薄切片粘附能力不高，经染色往往发生掉片，对于较大的切片其掉片的几率更大。之前有实验室利用防脱片剂APES来制作铜网支持膜，产生较好的效果；但此仍为有膜铜网，具有一定厚度，且不确定APES是否对样品有影响；而此前无膜铜网往往采用去静电的方法处理，需要有去静电设备，而且即使经去静电处理，在干燥的环境中经染色漂洗后仍然常发生掉片。

发明内容

为解决无膜铜网的掉片问题，本发明的目的是提供一种操作简便的处理透射电镜无膜铜网片的方法，通过以下步骤实现：

（1）配制0.2% Formvar 氯仿溶液；

（2）将新铜网用无水酒精清洗2 次，每次10min，再用无水丙酮清洗2 次，每次10min（有条件的可用超声清洗），去除铜网上的油污；

（3）用镊子夹取干燥清洁的铜网蘸一点新鲜配制的Formvar 氯仿溶液，马上平放在滤纸上吸干多余formvar 溶液，同时移动铜网使之不形成膜；

（4）将处理好的铜网置于干净滤纸上晾干待用。

本发明的另一个目的是提供上述方法处理的无膜铜网片在生物电镜超薄切片捞取样品中应用。本发明方法处理的铜网，在不形成支撑膜的同时，增加铜网与切片间的粘合度，防止超薄切片脱落，不影响样本反差，分辨率好，很好地解决干燥季节无膜铜网掉片问题，以及大面积切片的掉片问题。

本发明利用Formvar的粘附性，提出以formvar 氯仿溶液浸泡铜网，使之粘附于铜网支架上，但不形成膜的方法，处理铜网后捞片。实验结果表明，样品捞在蘸有formvar 的铜网上，经染色掉片率显著降低，且完全不影响样本反差，分辨率好。经近千例超薄切片生物样本电镜观察，证明此方法简单易行实用，值得推广。本发明方法是利用formvar 的粘附性来增加样品与铜网的粘附。经过处理过的铜网，对样品有很强的粘附性，染色掉片率低于0.5%，且由于没有形成支持膜，镜下观察不影响分辨率。本发明方法操作简单、省时省力，无需去静电设备，只需将铜网放入formvar 溶液中蘸一下即可，另外我们在工作中发现此方法处理过的铜网有消除静电的作用，铜网很容易捞片。

附图说明

图1是同一角膜病变病人的角膜病理样本，低倍镜下超薄切片经各组铜网捞片后比较（相同放大倍数）。

图2是同一角膜病变病人的角膜病理样本，高倍镜下观察各组铜网所捞超薄切片（相同放大倍数）。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1

一种处理透射电镜无膜铜网片的方法，通过以下步骤实现：

（1）配制0.2% Formvar 氯仿溶液。

（2）将新铜网用无水酒精清洗2 次，每次10min，再用无水丙酮清洗2 次，每次10min（有条件的可用超声清洗），去除铜网上的油污。

（3）用镊子夹取干燥清洁的铜网蘸一点新鲜配制的Formvar 氯仿溶液，马上平放在滤纸上吸干多余formvar 溶液，同时移动铜网使之不形成膜。

（4）将处理好的铜网置于干净滤纸上晾干待用。

实施例2  

1.使用实施例1的步骤制备蘸过formvar的无膜200目铜网；同时仅以酒精、丙酮超声处理相同批次市售200目铜网作为对照组。

2.用步骤1制备的2组铜网对超薄切片进行至上而下的捞片。

3.各组样品平行染色，电子显微镜下观察切片样品，处理组和对照组均结构清晰，分辨率好，处理不影响样本反差。

4.掉片情况：经我们对每组各超过500个铜网的统计，在干燥冬季用此方法的掉片率低于0.5%，而对照组掉片率高于30%。

实施例3

在一些特定实验中，往往需要制备面积较大的超薄切片，所选用载网的目数相应更大，针对这种切片，我们比较了本发明方法与传统方法制备的铜网的使用效果：