[发明专利]鳐血管生成抑制因子1功能区变体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及鳐血管生成抑制因子1功能区变体。 

背景技术

鳐血管生成抑制因子1功能区以下简称鳐功能区，鳐血管生成抑制因子1是从南海海域一种鳐组织中分离出来的蛋白质(分子量42KD)。研究结果显示：鳐血管生成抑制因子1显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜本身的及人鼻咽癌细胞诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成；无论是腹腔注射还是灌胃都显著抑制裸小鼠Lewis肺癌的生长和转移，减少肿瘤组织微血管密度，下调促血管生成因子VEGF的表达；对裸小鼠黑色素瘤B16细胞的转移也有强抑制作用；下调促转移因子CD44v6和ErBb2的表达；与5-氟尿嘧啶(5-FU)联合应用时效果更显著。鳐血管生成抑制因子1的作用靶点与美国基因技术研究所开发出的抗癌新药Avastin不同。Avastin是基因工程产品，是VEGF的抗体，其作用靶点是VEGF；鳐血管生成抑制因子1是天然产物，它不仅作用于VEGF，还作用于bFGF和PDGF。 

在现有技术中，为了提高蛋白的活性，针对蛋白的特异位点进行特异性的突变和取代，从而寻找活性更高的变体是常规的做法。为了进一步提高该蛋白的生物活性，申请人通过大量的实验，针对鳐血管生成抑制因子1功能区氨基酸序列中特定的位点进行了点突变，从而获得了比鳐血管生成抑制因子1功能区本身具有更高抑制活性的变体。 

发明详述 

本发明涉及亲本蛋白的分离的变体，其在至少一个对应于SEQ ID NO：1的功能区的位置9R、17F、42H、57S、62R、71K、80N、89P、100G、101R、129A、134E、151Q、163P、189K或217R的位置包含修饰。具体而言，本发明的变体具有改善的抑制活性。 

优选地，应用于本发明的方法、呈现改善的抑制活性的蛋白变体为以下任一修饰：9R/G、17F/S、42H/D、57S/L、62R/V、71K/R、80N/W、89P/V、100G/E、101R/C、129A/G、134E/S、151Q/N、163P/K、189K/R或217R/T。 

本发明还涉及产生本发明的蛋白变体的方法，包括(a)培养宿主细胞；和(b)回收所述蛋白变体。 

在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。 

所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。 

本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)。 

本发明的多肽用于制备相应的药物，去用于抑制癌症。 

具体实施方式

实施例1 

1.鳐血管生成抑制因子1功能区的获得 

鳐功能区由下列氨基酸残基按下列顺序组成： 

TLD1YKQLRDKETPSGFTLDDV1QTGVDNPGHPF1MTVGCVAGDEESYEVFKALFDPV1QDRHGGYKPTDKHKTDLNHENLKGGDDLDPNYVLSSRVRTGRS1KG1ALPPHCSRGERRLVEKLCLEGLATLTGEFQGKYYPLTTMSDAEQQQL1DDHFLFDKPVSPLLLASGMARDWPDARG1WHNNDKTFLVWVNEEDHLRV1SMQKGGNMKEVFRRFCVGLKK 

2、鳐血管生成抑制因子1功能区变体的构建 

突变点的引入