[发明专利]基于连接酶反应的杂交高通量DNA测序方法

权利要求书

1.一种基于连接酶反应的杂交高通量DNA测序方法，其特征在于确定未知DNA模板的碱基信息是通过DNA模板与多条标记DNA探针平行杂交并连接标记DNA探针，通过检测是否有标记物连接，根据碱基互补原理确定未知DNA模板是否有对应的四个或四个以上连续碱基的信息；即通过对DNA模板重复“杂交一连接一检测”步骤来实现；即DNA序列确定是通过一套一个末端包含有4个己知碱基的DNA杂交引物与一套标记DNA探针在连接酶的作用下平行地与待测DNA序列经过多轮连接、检测来实现；所述DNA杂交引物是5’p-NNNN 3’或者5’NNNN3’；当所述DNA杂交引物是5’p-NNNN 3’时，采用序列为序列1-4的一套标记DNA探针；当所述DNA杂交引物是5’NNNN3’时，采用序列为序列5-8的一套标记DNA探针；其中N为四种碱基T、A、G、C中任意一种或者通用碱基I，W、X、Y、Z均是选自T、A、G、C中的确定的一种碱基，构成序列确定的已知碱基末端；DNA杂交引物中XYZW组成256种不同序列，构成一套DNA杂交引物；所述DNA杂交引物，当已知碱基末端位于5’末端，为使连接反应能进行则该5’末端含有磷酸基团；当已知碱基末端位于3’末端，为使连接反应能进行则该3’末端含羟基基团且5’末端为非磷酸基团；

所述方法包括如下步骤:

步骤1)连接：混合DNA杂交引物中的一条与一套标记DNA探针及连接缓冲液，在连接酶的作用下，在DNA杂交引物的已知碱基末端连接上标记DNA探针；通过检测信号强度读取连接标记DNA探针的信息，确定未知DNA模板上的包含数个碱基的序列；

步骤2)变性洗脱：用DNA变性试剂把待测DNA恢复单链DNA状态；

步骤3)重复：再将另一末端已知碱基序列不同的DNA杂交引物按步骤1)与未知DNA模板杂交并进行步骤2)，确定未知DNA模板上的包含数个碱基的不同序列；用不同的DNA杂交引物重复上述过程，直到完成DNA序列测定；即确定未知DNA模板的DNA序列是根据DNA杂交引物己知碱基和所连接的标记DNA探针，通过碱基互补原理确定。

2.根据权利要求1所述的基于连接酶反应的杂交高通量DNA测序方法，其特征在于，所述的已知碱基为四种碱基dT,dA,dG,dC中的任意一种，且序列是已知。

3.根据权利要求1所述的基于连接酶反应的杂交高通量DNA测序方法，其特征在于所述的标记DNA探针，其标记DNA探针上非连接末端包含可以直接或者间接检测的基团或者粒子。

4.根据权利要求3所述的基于连接酶反应的杂交高通量DNA测序方法，其特征在于，所述的可检测的基团或者粒子，为修饰荧光基团、生物素或量子点。

5.根据权利要求1所述的基于连接酶反应的杂交高通量DNA测序方法，其特征在于所述的未知模板DNA，通过化学或者物理方法固定在平面基片、96孔板、384孔板或者各种修饰的珠子载体上；未知单链DNA模板可以通过常规的PCR、滚环扩增、固相扩增、桥式扩增以及固相酶连接反应的方法增加其分析用数量，扩增是单重的，即一次扩增一个目的片断，或是多重的，即一次扩增多个目的片断。

6.根据权利要求1所述的基于连接酶反应的杂交高通量DNA测序方法，其特征在于所述的DNA变性试剂中含有能降低DNA变性温度的尿素、NaOH、乙二醇、丙三醇或甲酞胺组分。