[发明专利]基于枯草芽孢杆菌AR/BDH酶学性质高效发酵生产乙偶姻的策略

说明书

技术领域

一种基于枯草芽孢杆菌AR/BDH酶学性质提高乙偶姻产量发酵策略，本发明属于基因工程和发酵工程领域。具体涉及一种乙偶姻还原酶/2，3-丁二醇脱氢酶基因工程菌的构建及基于该酶酶学性质提高乙偶姻产量的发酵策略。

技术背景

乙偶姻在食品调香、生化及药理方面有着广泛的应用价值，目前国内外对其合成和生产都有着比较深入的研究。自然界中的某些细菌具有生产乙偶姻的能力，主要包括克雷伯氏菌属(Klebisella)、肠杆菌属(Enterobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)以及乳球菌属(Lactococcus)等。但是在大多数菌株代谢过程中，乙偶姻是作为2，3-丁二醇和丁二酮代谢的副产物而存在的，积累浓度较低，从而直接导致了难以利用这些微生物菌种工业化发酵生产乙偶姻。

本实验室保藏有一株以葡萄糖为底物高产乙偶姻的枯草芽孢杆菌B.subtilis JNA(保藏号CCTCC M209309；专利申请公布号CN101864381A)，研究发现其发酵过程中存在乙偶姻和2，3-丁二醇相互转化的现象，这一相互转化过程受到乙偶姻还原酶的调节。乙偶姻还原酶，又称2，3-丁二醇脱氢酶(简称AR/BDH，E.C.1.1.1.4)。隶属于氧化还原酶，能够在NADH存在的情况下催化乙偶姻生成2，3-丁二醇，同时在NAD⁺存在的情况下催化2，3-丁二醇可逆形成乙偶姻。在枯草芽孢杆菌相关研究中，虽已确定了编码乙偶姻还原酶/2，3-丁二醇脱氢酶的基因，并命名为bdhA，但对其相关性质未能进一步研究。

本发明通过表达载体pMA5，实现了B.subtilis JNA乙偶姻还原酶(简称bdhA)的高效表达，首次对该酶进行了相关酶学性质研究。为枯草芽孢杆菌后期2，3-丁二醇逆向转化乙偶姻的机理研究提供了基础，并基于乙偶姻还原酶酶学性质，通过发酵策略调控，达到缩短发酵周期，加强后期逆向转化能力的目的，最终实现B.subtilis JNA高效生产乙偶姻。

发明内容

本发明所使用菌种为B.subtilis JNA，该菌株前期发酵葡萄糖合成2，3-丁二醇，后期逆向转化为乙偶姻，已保藏于中国典型培养物保臧中心，保藏地址：中国武汉，武汉大学；保臧编号为：CTCCM209309。

本发明的主要研究内容：本发明利用分子技术克隆了来自B.subtilis JNA的乙偶姻还原酶基因(简称bdhA)，构建重组表达载体pMA5-bdhA，并将其转化至B.subtilis JNA，成功构建了基因工程菌株B.subtilis JNA/pMA5-bdhA。对构建的基因工程菌株进行酶活力测定及酶学性质研究发现：酶还原方向反应最适pH为6.5，酶氧化方向反应最适pH为8.5。基于这一酶学性质，通过发酵策略调控，发酵前期使菌株处于最适生长条件(pH6.5)，发酵后期通过加强逆向转化能力(pH8.0)，最终B.subtilis JNA发酵96h，150g/L葡萄糖转化为乙偶姻约56.8g/L，副产物2，3-丁二醇仅为6.1g/L，并且乙偶姻产率达到0.59g/(L·h)，与未经过发酵策略调控比较，产率提高了近84％。利用相同发酵策略，重组菌株B.subtilis JNA/pMA5-bdhA在前期控制pH6.5后期控制pH8.0条件下发酵96h，最终消耗180g/L葡萄糖，乙偶姻产量提高至约73.6g/L，产率最终达到0.77g/(L·h)。

本发明的优点和积极效果是：

(1)本发明首次探索了枯草芽孢杆菌来源的乙偶姻还原酶的酶学性质，为枯草芽孢杆菌后期2，3-丁二醇逆向转化乙偶姻的现象提供了一定的理论价值。

(2)本发明基于乙偶姻还原酶的酶学性质，通过发酵策略调控，发酵前期使菌株处于最适生长条件(pH6.5)，发酵后期通过加强逆向转化能力(pH8.0)，实现高效生产乙偶姻的方法，最终B.subtilis JNA将150g/L葡萄糖转化为乙偶姻约56.8g/L，副产物2，3-丁二醇仅约为6.1g/L，并且乙偶姻产率达到0.59g/(L·h)，与未经过发酵策略调控比较，产率提高了近84％；重组菌株B.subtilis JNA/pMA5-bdhA最终将180g/L葡萄糖转化为乙偶姻提高至约73.6g/L，产率最终达到0.77g/(L·h)。

附图说明

图1重组质粒pMA5-bdhA示意图。

图2SDS-PAGE分析蛋白纯化情况。

图3pH对酶活力的影响。

图4菌株B.subtilis JNA在5L-罐发酵曲线。