[发明专利]12F型肺炎球菌单克隆抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学检测领域，具体地说，涉及12F型肺炎球菌单克隆抗体及其应用。 

背景技术

肺炎抗体是指动物抗肺炎球菌各型别荚膜多糖产生的的IgG、IgM等类型抗体的总称，广泛应用于肺炎链球菌菌株鉴定、肺炎多糖疫苗以及肺炎结合疫苗中各型别多糖的定性和定量检测。 

目前世界上广泛应用的肺炎抗体主要来自兔血清。丹麦血清研究所(SSI)使用各型别肺炎球菌静脉注射兔子，制备兔抗各型肺炎荚膜多糖的血清，应用于肺炎球菌菌种鉴定以及肺炎荚膜多糖含量测定等实验。由于肺炎荚膜多糖成分复杂，许多型别之间存在交叉反应(如6A和6B，19A和19F等)，使用此方法制备的肺炎多糖抗体为多抗的混合物，特异性差，不同型别之间存在交叉反应，只有通过多次菌体吸附，才能降低交叉作用的发生，因而给鉴定工作带来不必要的麻烦，同时增加了实验误差，此外，该方法制备的抗体水平较低，抗体滴度小，抗体效价不高，稳定性差，易降解，为抗体的长久保存带来困难。因此，制备出特异性好、抗体滴度高且稳定性好的肺炎多糖抗体成为了亟待解决的问题。 

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种特异性好、抗体水平高且能长期保存的12F型肺炎球菌单克隆抗体。 

为了实现本发明目的，本发明通过将免疫肺炎多糖原液的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，分离出能够分泌肺炎抗体的单克隆杂交瘤细胞，接种小鼠腹腔，制备含有特异性肺炎抗体的腹水，经过后期处理 并验证，得到一种特异性好、抗体水平高且能长期保存的肺炎抗体。 

本发明首先提供了一种肺炎12F型单抗杂交瘤细胞株Sino12F。该杂交瘤细胞株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.9235，保藏日期2014年5月26日。 

本发明还提供了由上述杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。 

具体而言，本发明采用小鼠骨髓瘤细胞杂交瘤技术制备12F型肺炎球菌单克隆抗体，包括如下步骤： 

1)动物免疫 

12F型肺炎球菌多糖原液与弗氏完全佐剂等体积混合后进行乳化背部皮下注射小鼠，后与弗氏不完全佐剂等体积混合后乳化进行第二次和第三次免疫，若第三次免疫后，抗体效价经ELISA方法检测抗体滴度在10000以上，则认为合格，腹腔注射12F型肺炎多糖原液进行加强免疫，不用乳化，剂量与前三次相同。 

2)脾细胞融合 

将脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按一定比例混合，37℃水浴融合。将PEG滴入混合系中；缓慢加入无血清的IMDM培养基，离心弃去上清后加入IMDM完全培养液，将混悬液分别加至96孔细胞培养板中，CO2培养箱内培养后，添加HAT培养液。 

3)杂交瘤细胞长至一定程度时进行抗体ELISA检测，及时做亚克隆。将HT培养基稀释的杂交瘤细胞加入96孔板培养。培养两周后将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养，并冻存。 

4)冻存的单克隆细胞进行复苏，培养，25ml的细胞培养瓶细胞覆盖瓶底70％-80％时进行腹腔接种Balb/c雌性小鼠，定期收集腹水。 

进一步地，本发明还提供了包括上述单克隆抗体的试剂盒，用于检测肺炎球菌12F型多糖。 

进一步地，所述单克隆抗体经生物标记或化学标记。 

作为优选，所述标记为酶标记。 

更为优选，所述标记为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记。 

本发明还提供了所述单克隆抗体在检测肺炎多糖疫苗中12F型多糖含量中的应用。 

作为优选，所述单克隆抗体经生物标记或化学标记。 

本发明采用12F型多糖原液免疫小鼠，制备小鼠脾细胞并与骨髓瘤细胞进行融合，制备能够分泌12F型单克隆抗体的单克隆细胞株，腹腔接种小鼠制备12F型单抗腹水。 

本发明的有益效果在于： 

1、使用12F型肺炎多糖原液与弗氏佐剂乳化后免疫小鼠，与菌体免疫相比具有较好的特异性。 

2、筛选杂交瘤细胞时，除用12F型多糖检测细胞上清为阳性外，还用CPS多糖检测细胞上清为阴性，确保杂交瘤细胞分泌的抗体只是针对12F型多糖，不含抗CPS多糖的抗体。 

3、制备的12F型单抗腹水经过验证后，可以用于速率免疫浊度法检测12F型多糖含量、双抗体夹心法检测肺炎多糖含量，以及进行酶标记之后制备酶标二抗。