[发明专利]一种携带双自杀基因的可回复永生化肝细胞株及其构建方法

权利要求书

1. 一种可回复永生化肝细胞株的构建方法，从胚胎期12.5～14.5d天的小鼠肝脏中分离肝脏祖细胞，导入含有SV40T基因和HSV-TK基因的逆转录病毒，筛选具有肝祖细胞标志及向成熟肝细胞分化功能的单克隆细胞株，再导入含有CD基因的逆转录病毒获得携带双自杀基因的可回复永生化小鼠肝祖细胞。

2. 如权利要求1所述的可回复永生化肝细胞株的构建方法，所述含有SV40T基因和HSV-TK基因的逆转录病毒结构如图1-1所示。

3. 如权利要求1或2所述的可回复永生化肝细胞株的构建方法， 所述含有CD基因的逆转录病毒结构如图1-2所示。

4. 如权利要求1或2所述的可回复永生化肝细胞株的构建方法，包括以下步骤：

（1） 携带SV40T永生化基因和HSV-TK自杀基因的肝祖细胞构建，单克隆筛选及生物学性状鉴定：

①从胚胎期12.5～14.5d的小鼠肝脏中分离出肝祖细胞；用携带SV40T永生化基因及HSV-TK自杀基因的逆转录病毒感染肝祖细胞，经潮霉素抗性加压筛选获得的永生化细胞呈克隆样生长；

②单克隆细胞筛选：以有限稀释法接种细胞于96孔培养板，至每孔一个细胞为止，潮霉素改半量维持；观察96孔培养板中有单克隆细胞团形成的孔标记，待细胞融合度达80％时常规传代，扩大培养，获得多株单克隆细胞；

③单克隆细胞鉴定与筛选：以LC14d成熟肝细胞及Hepa1-6肝肿瘤细胞株为对照，筛选能高表达DLK、POU5f1肝干/祖细胞标志，低表达AFP、ALB、CK18、CK19肝细胞特异基因的肝祖细胞；

④单克隆细胞的诱导分化鉴定：用Dex/DMSO体外诱导成熟肝细胞分化，进行PAS染色及ICG摄取筛选具有体外成熟肝细胞分化能力的细胞；

⑤可回复永生化的检测：用腺病毒介导的Cre重组酶敲除两个同向LoxP位点间的序列，48h后检测到SV40大T抗原被可逆敲除，并检测细胞增殖速度，通过荧光素酶报告基因检测ALB表达水平，Western blot检测细胞的体外诱导分化能力；

⑥单克隆细胞的安全性检测：腺病毒介导firefly luciferase体内示踪，将Luc标记后的细胞皮下植入裸鼠，分别于植入后第ld、1w、4w活体组织成像动态观察植入细胞的生长情况；

（2） 导入CD自杀基因，构建携带双自杀基因的可回复永生化肝祖细胞株及功能鉴定：

①pSEB-CD载体的构建及鉴定：BamHⅠ/SalⅠ酶切位点双酶切带有CD自杀基因全长序列的pIRES-CD质粒，获得1300bp左右的特异性条带，胶回收后连接至同样双酶切的pSEB-3F载体，经Amp筛选，菌落PCR获得阳性克隆；提质粒，EcoRⅠ/SalⅠ酶切获得约2300bp的特异性条带，测序检测pSEB-CD质粒构建成功；

②导入CD基因，构建携带双自杀基因的肝祖细胞株：pSEB-CD与pCL-Ampho包装质粒共转染HEK293细胞，获得逆转录病毒，每ml逆转录病毒加2mg/ml 的polybrene 5μl,用0.45μm孔径的滤器过滤，感染步骤（1）所得单克隆肝祖细胞，过夜后换新鲜培养基，48h后加入终浓度为3μg/ml的BSD；BSD筛选10d，保留存活细胞，维持筛选浓度，存活细胞开始恢复正常的生长速度及状态，获得携带双自杀基因的可回复永生化肝祖细胞株；

③CD基因的表达及活性检测：Western blot及免疫荧光检测细胞中CD基因的蛋白水平表达；采用100μg/ml的5-氟胞嘧啶作用于细胞株，7d后进行结晶紫染色及MTT检测细胞抑制率；

④携带CD自杀基因的肝祖细胞株的体内安全性检测：将Luc标记的双自杀基因的可回复永生化肝祖细胞株植入裸鼠皮下，体内给药5-FC，于植入后第0天、5天、10天检测细胞的存活情况；

⑤Cre-LoxP重组效率及HSV-TK自杀基因活性的检测：采用3.3μg/ml的GCV作用于细胞株检测，CRE敲除SV40T及HSV-TK基因后，在GCV中存活细胞，SV40T表达完全消失。