[发明专利]一种离体鱼类性腺内类固醇类性激素的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及化学分析检测技术领域，具体涉及一种离体鱼类性腺内类固醇类性激素的检测方法及其应用。

背景技术

虽然近年来鳗鲡的人工繁殖初见成果，但对于在其性腺发育过程中性腺组织中的性腺激素含量会在不同阶段，并且随着不同激素的注射而有所改变，尤其是雌二醇、雌三醇、雌酮、孕酮、17α-羟孕酮、17α，20β-二羟-4-孕烯-3-酮(DHP)、睾酮、表睾酮对鳗鲡的成熟和产卵有着重要的影响。

在过去30年中，有大量的研究证实，睾酮和DHP二者相互协调，共同激发着鳗鲡精子的形成；鱼类中，脑垂体分泌GtH，GtH含两种糖蛋白促性性腺激素(即LH和FSH)，进而促进雄鱼血液中DHP和睾酮的分泌来调控性腺的发育与成熟；而在雌鱼中，这两种激素会促进分泌形成雌二醇，雌二醇会进而刺激肝脏合成与分泌卵黄蛋白原；另一方面同样会刺激滤泡颗粒细胞分泌DHP，DHP是诱导卵巢最后成熟与排卵的重要激素。Katsumi Tsukamoto等对捕获的日本鳗鲡通过RIA和TLC法对它们进行血清类固醇激素的检测，发现在日本鳗鱼排卵期间，DHP约1ng/ml，而在人工催熟的日本鳗鱼的同一期间没有检测这种类固醇激素，同时在人工繁殖的日本鳗鱼的卵黄发生的中后期检测血清中雌二醇(雌甾体类激素)含量为2-3ng/ml，睾酮(精子发生诱导类固醇)在捕获的雄性鳗鱼体内的含量是很高的(2-5ng/ml)，含量类似与人工繁殖的成熟雄鳗中。因此，准确掌握鳗鲡性腺组织中性激素周期性的浓度变化是决定人工繁殖鳗鲡成功与否的关键。

由于类固醇类激素在离体鱼类性腺中的浓度通常很低，而离体鱼类性腺作为鱼类组织中结构最为复杂的器官，不仅蛋白质含量高，而且油脂含量高，干扰物质多，类固醇类激素作为脂溶性的激素，在提取的过程中很容易损耗。因此，本发明的目的在于建立可靠、稳定的定性定量分析方法，并通过有效的富集、分离和纯化过程实现高灵敏度、高专属性分析，为进一步研究类固醇类激素在鱼类性腺内的代谢及消耗过程奠定基础，为人工繁殖鱼类提供科学方法。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种UPLC-MS/MS检测离体鱼类性腺内类固醇类性激素的方法。所述方法能够对离体鱼类性腺内八种类固醇类性激素：雌二醇、雌三醇、睾酮、表睾酮、孕酮、17α-羟孕酮、雌酮、17α，20β-二羟基-4-孕烯-3-酮(DHP)进行同时分析检测。本发明的方法通过对多成分类固醇类性激素含量的测定可以比较全面地反映性激素在性腺中累积、传递和代谢过程，为准确评估鱼类的发育时期提供依据。

为实现上述及其他目的，本发明采用以下技术方案：

一种离体鱼类性腺内类固醇类性激素的检测方法，为采用UPLC-MS/MS定性或定量检测离体鱼类性腺内类固醇类性激素，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：称取离体鱼类性腺组织，经前处理，得供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：称取未成熟离体鱼类性腺组织样品，加入类固醇类性激素标准品溶液，经和步骤(1)相同的前处理，得对照品溶液；

(3)测定：采用UPLC-MS/MS分别对供试品溶液和对照品溶液进行定性或定量检测。

较佳的，所述鱼类为花鳗鲡鱼或河鳗(日本鳗鲡)。

较佳的，所述类固醇类性激素选自雌二醇、雌三醇、睾酮、表睾酮、孕酮、17α-羟孕酮、雌酮或17α，20β-二羟基-4-孕烯-3-酮(DHP)中的一种或多种。

较佳的，步骤(1)中，所述前处理，包括如下步骤：

1)将离体鱼类性腺组织样品，加入匀浆介质，匀浆，得匀浆液；

2)将所得匀浆液超声，离心，冷冻；

3)将所得冷冻后的样品，离心，取上清液进行过滤，将所得过滤液旋转蒸发浓缩，加步骤1)中所用匀浆介质溶解，静置；

4)离心，取上清液进行过滤，得续滤液作为供试品溶液。

较佳的，步骤1)中，所述匀浆介质为乙腈、甲醇中的任一种。

较佳的，步骤1)中，每1g的离体鱼类性腺组织样品中加入匀浆介质8-15ml。更佳的，每1g的离体鱼类性腺组织样品中加入匀浆介质10-15ml。

所述离体鱼类性腺组织样品称取时，应当精密称取。

所述甲醇为100％甲醇。