[发明专利]高产杆状病毒的昆虫细胞系及其应用

说明书

技术领域

本发明涉一种新的昆虫细胞系，具体涉及一种高产杆状病毒的昆虫细胞系及其应用。

背景技术

近20年来BEVS被成功地用于表达了许多外源基因的实践证明，目前有3个相对比较好的细胞系具有良好的性质适用于AcMNPB和BmNPV重组蛋白表达的研究和生产，它们是来源于秋粘虫卵巢组织的IPLB-SF21AE(Sf21)细胞系及其衍生株Sf9和来自甘蓝尺镬的BTI TN5B1-4(High Five)细胞系以及来源于家蚕卵巢的BmN及其亚系。这些昆虫细胞系没有一个象许多普通应用的哺乳动物细胞系那样含有潜在有害的转化因子。最近Protein Science公司报道了一个新的取得了商业许可的细胞系(Express SF+)，该系比Sf9更优秀，另一商品化的昆虫细胞系Ea4(Novagen公司)-BTI EAA细胞系的亚系能在表达产物上附加复杂的糖链。近年来从不同的鳞翅目昆虫中建立了许多新的细胞系，但尚未发现在蛋白表达方面表现优秀的细胞系。鉴于这一原因，不少科研将研究重点转移到对现有细胞株进行改造与筛选上。以提高重组杆状病毒的产毒量、目标蛋白的表达产量。

昆虫细胞属于半贴壁细胞，贴壁培养时需要添加10％的胎牛血清(FBS)，悬浮培养时可以用无血清悬浮培养基进行培养，现有的利用BEVS系统表达蛋白，用来制备疫苗均采用悬浮培养的方式进行。因此采用的昆虫细胞系的倍增时间、能达到的最高密度、生产杆状病毒的能力、对病毒的敏感性、表达外源基因的能力成为选择的首要标准。

目前国内外已经利用昆虫-杆状病毒表达系统已经成功开发上市了多种疫苗产品：人用上市疫苗包括：GSK公司的二价宫颈癌疫苗(CERVARIX)，Protein Sciences公司的三价流感疫苗(FLUBLOK)、Dendreon公司的前列腺癌疫苗(PROVENGE)、uniQure公司的脂蛋白脂酶缺乏症的基因治疗疫苗(Glybera)，兽用上市疫苗包括牛环状病毒疫苗(Intervet/Schering-Ploug(Merck))、猪瘟病毒疫苗(Intervet/Schering-Plough(Merck))等，以及处于临床期的十多种疫苗。

将目标基因经过优化，然后通过分子生物学手段，构建获得重组杆状病毒，再通过杆状病毒感染昆虫细胞，经过表达获得目标蛋白，在经过各种纯化手段获得符合要求的目标产物，是目前利用昆虫-杆状病毒表达系统开发疫苗产品的基本思路。

目前已经上市和正处于临床期间的利用该表达系统生产的疫苗在大规模临床实验中显示出较好的预防效果，这是因为利用昆虫细胞生产的蛋白质更容易糖基化，使蛋白质更加接近天然状态的活性。

非专利文献1：Rose，R.C.，Bonnez，W.，Reichman，R.C.，Garcea，R.L.，1993.Expression of human papillomavirus type 11 L1 protein in insect cells：in vivo and in vitro assembly of virus-like particles.J.Virol.67，1936-1944.

非专利文献2：Protein Sciences Corporation，Meriden.FluBlok，a next generation influenza vaccine manufactured in insect cells.Biologicals.2009Jun；37(3)：182-9.doi：10.1016/j.biologicals.

2009.02.014.Epub 2009 Mar 17

非专利文献3：Lin YL，Yu CI，Hu YC，Tsai TJ，Kuo YC，Chi WK，Lin AN，Chiang BL Enterovirus type 71 neutralizing antibodies in the serun of macaque monkeys immunized with EV71 virus-like particles.Vaccine.2012 Feb 8；30(7)：1305-12.doi：10.1016/j.vaccine.2011.12.081.Epub 2011 Dec 31.

专利文献1：WO2007/018049

上述非专利文献1～3和专利文献1的全部记载在此作为本申请的特别公开内容。