[发明专利]一种人免疫球蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种人免疫球蛋白的制备方法，属于血液制品领域。

背景技术

人血浆蛋白制品是宝贵的人源性生物类药品。自从20世纪40年代Cohn教授建立了工业化规模分离血浆蛋白的低温乙醇法分离工艺以来，血液制品的开发，特别是临床应用、市场份额以及制品安全性和生产工艺均发生了质的飞跃。

然而与发达国家相比，无论在高技术研发或临床应用研究方面，我国还有很大差距。国内现采用的生产工艺大部分是低温乙醇分离法加低pH孵放灭活法和DV50纳米膜除病毒，采用双重灭活方式来保障制品的安全性。但是此工艺生产周期长，单位时间内制品产率和纯度偏低。

在如今血液制品需求量不断增加，市场缺口越来越大的形势下，开发出一种产率高、周期短的安全有效的人免疫球蛋白的制备方法显得至关重要。

发明内容

本发明主要针对上述所说的产率及纯度低、周期长的问题提供了一种人免疫球蛋白的制备方法。

本发明一种人免疫球蛋白的制备方法，其操作步骤包括：

1、血浆采集：收集具有高效价的原料血浆；

2、组分分离：将上述原料血浆用0.14mol/L氯化钠溶液稀释，并用pH为4.0的醋酸缓冲液调pH为7.10±0.04，降温至0℃开始喷入-15℃以下的95%的乙醇，使最终乙醇浓度达到12%(v/v)，控制温度在-2.5±0.5℃，用醋酸缓冲液调pH为7.10±0.04，搅拌2小时，加入硅藻土，压滤分离出上清液A，压滤时控制压力≤0.1MPa；

3、沉淀压滤：向上述上清液A中继续喷入-15℃以下的95%的乙醇，使最终乙醇浓度达到20%(v/v)，控制温度在-5.0±0.5℃，用pH为4.0的醋酸缓冲液调pH为6.80±0.04，搅拌2小时，静置两小时，按照硅藻土(Kg)=25×V反应液(L)/1000的公式加入硅藻土，压滤分离，收集沉淀物B；

4、沉淀溶解：每Kg沉淀用9L 0.01mol/L氯化钠溶液将沉淀物B溶解后，加pH为4.0的醋酸缓冲液调pH为5.00±0.04，喷入-15℃以下的95%的乙醇至最终乙醇浓度为17%，控制温度在-4.5~-5.5℃，搅拌2小时，静置6小时以上，对反应液进行压滤分离，压滤时压滤控制在≤0.1MPa，收集压滤液C，冷却至-3~-5℃；

5、超滤浓缩：用0.5mol/L盐酸溶液调压滤液C pH为3.8~4.0，使用5倍体积的2~8℃注射用水进行透析，透析至乙醇含量＜1%，浓缩至蛋白浓度＞3%，收集蛋白浓缩液D；

6、层析提纯：用pH为4.0的醋酸缓冲液调蛋白浓缩液D pH为4.00~4.50，然后用由1mol/L的磷酸溶液与1mol/L的NaOH溶液配制而成的磷酸—NaOH缓冲液调节电导率为0.15~0.17s/m，然后将蛋白液上预先用磷酸—NaOH缓冲液平衡好的Macrocap-Q离子交换柱进行层析提纯，收集层析蛋白液E；

7、透析浓缩：向层析蛋白液E中边搅拌边缓慢加入0.5mol/L盐酸液，调节pH至3.80~4.00，用6倍体积的2~8℃注射用水透析，透析至乙醇含量＜0.025%，将蛋白液浓缩至6%以上浓度，收集蛋白浓缩液F；

8、S/D灭活：将蛋白浓缩液F用1μm滤板于室温中进行过滤，之后加入磷酸三丁脂(TNBP)和吐温-80，使得最终浓度为0.3%TNBP和1%吐温-80，控制温度在24.0±1.0℃，缓慢搅拌6小时进行S/D灭活；

9、吸附纯化：收集灭活混合液G，上预先用0.16mol/L的NaCl平衡好的DEAE-纤维素柱，然后用0.21mol/L NaCl洗涤10次，再使用0.28mol/L NaCl洗脱3次，用0.45~1.0滤芯的澄清过滤器过滤蛋白洗脱液，收集过滤后的蛋白过滤液H；

10、超滤浓缩：将蛋白过滤液H用5倍体积的2~8℃注射用水进行透析，将蛋白液浓缩至10%以上浓度，收集蛋白浓缩液I；

11、半成品配置；

12、DV50纳米膜除病毒；

13、分装：将上步收集的蛋白液用1M碳酸氢钠溶液调整pH至6.4~7.4分装。

其中：所述的醋酸缓冲溶液的pH为4.0，冷乙醇是-15℃以下的95%的乙醇。

其中：所述的硅藻土的加量(Kg)=25×V反应液(L)/1000。

其中：所述的压滤时的压力控制在≤0.1MPa，超滤时用的注射用水的温度控制在2-8℃。