[发明专利]一种解脂耶氏酵母W29脂肪酶的分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及分离纯化技术领域，尤其涉及一种解脂耶氏酵母W₂₉脂肪酶的分离纯化方法。

背景技术

解脂耶氏酵母菌(Y.lipolitica)首次发现于1942年，是一种非常规性的、不致病的、严格好养的酵母，属于子囊酵母。常生活在含肉质沙拉、酱油等富含脂类、蛋白质等物质的地方，其生长温度为25～30℃，生存pH3.0～8.0，可以利用疏水物质如乙醇、油类、脂肪酸，烷烃类如氯化烷烃、聚甲基化，糖类如葡糖糖、蔗糖、麦芽糖等作碳源进行生长。Y.lipolitica能产生大量的有机酸(如a-酮戊二酸、柠檬酸、异柠檬酸等)、胞外酶(胞外酸性蛋白酶、胞外碱性蛋白酶、胞外脂肪酶和酯酶酯、胞外磷酸酶、胞外RNase、a-甘露糖苷酶等)等产品，它的蛋白分泌模式具有典型性，常被用于研究蛋白质分泌的模式生物，基于以上特性使得其在科学研究、工业领域都得到了广泛的应用。特别是其对油脂废水处理方面的运用，如吴兰等发现Y.lipolitica W₂₉对色拉油和餐饮油废水有较高的降解能力，即在温度为25～30℃、pH6.0～7.0、培养时间为50h、摇床转速200r/min的条件下，对油含量≤2000mg/L的色拉油和餐饮废水的降解率达到了93.3％和85.08％，且发现Y.lipolitica W₂₉通过产生脂肪酶来对油脂进行降解。

1948年，Nelson和Peters首次报道了解脂耶氏酵母能产大量脂肪酶，其可以在异相或有机相中催化水解、酯化、转酯、氨解等反应，且底物广泛，具有很高的底物特异性、区域选择性和对映选择性。这些优点使其拥有广泛的工业用途，如环保、洗涤、有机物合成、油脂加工、食品加工、药物合成、生物能源等。Gerardo等发现用橄榄油或玉米油做碳源以及诱导剂、在培养基中添加吐温-80、降低通气量都可以使Y.lipolitica提高脂肪酶的产量；Destain等利用突变的方法提高Y.lipolitica的产酶能力，使其产酶能力提高了近30倍；Ficker等运用诱变的方法筛选出解除葡萄糖抑制的Y.lipolitica菌种，其产酶酶活提高了10倍；Pignede等运用分子生物学手段从Y.lipolitica中获得了Lip2基因，发现表达Lip2有脂肪酶特性，但当敲除Lip2基因后，Y.lipolitica在仅以三丁酸甘油酯为碳源的平板上还能正常生长，说明Y.lipolitica中还存在其他的降解三丁酸甘油酯的途径。

不同微生物来源的脂肪酶有着不同的催化特性和催化活力，其组成成分也各有不同，因此分离纯化脂肪酶的方法和步骤也有所不同。微生物脂肪酶分离纯化主要通过两大技术：1)沉淀技术，主要包括硫酸铵、乙醇和丙酮沉淀；2)层析技术，主要包括离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤等来完成。为了获得最大的酶回收率和纯化倍数，通常在脂肪酶提取纯化过程中采用多步纯化法。一般先用非特异、低分辨率的操作单元浓缩样品，以此浓缩蛋白样品并提高目的蛋白浓度，去除最主要的杂质；然后采用高分辨率的操作单元如离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析等。后者一般具有高选择性分离规模大的离子交换层析和亲和层析放在前面，而将凝胶过滤层析这类分离规模小、分离速率慢的操作单元放在最后，这样可以有效提高分离效率，减少蛋白损失。

因此，寻找简单易行的脂肪酶分离纯化方法对于解脂耶氏酵母W₂₉的利用有着重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种解脂耶氏酵母W₂₉脂肪酶的分离纯化方法。

本发明采用如下技术方案：

本发明的解脂耶氏酵母W₂₉脂肪酶的分离纯化方法的具体步骤如下：

(1)往含有解脂耶氏酵母W₂₉脂肪酶的发酵上清液中加入含有EDTA的饱和硫酸铵溶液，使其终饱和度为30-55％，然后调节pH至4.5-6.5，在冰上放置10h后，进行离心得到沉淀；

(2)将步骤(1)得到的沉淀，进行透析除盐，得到粗酶液；

(3)将步骤(2)得到的粗酶液进行低速离心，然后通过DEAE-SepharoseFF凝胶过滤层析，然后收集洗脱液，将洗脱液经PEG20000浓缩后，与甘油混合，放入-20℃下保存。

步骤(1)中，EDTA在溶液中的最终浓度为1mM。

步骤(1)中，硫酸铵溶液的终饱和度优选为45％。

步骤(1)中，使用硫酸或氨水调节pH值。

步骤(1)中，优选调节pH至6.0。