[发明专利]一株单增李斯特菌单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株单增李斯特菌单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，具体涉及单克隆细胞株A号及其产生的单增李斯特菌单克隆抗体的应用，属于食品安全免疫学检测技术领域。

背景技术

单增李斯特菌(L.monocytohenes)是一种广泛存在于环境中的革兰氏阳性菌，是国际上重要的人畜共患病原菌。单增李斯特菌是李斯特菌的一种，其它李斯特菌包括绵羊李斯特菌 (L.iuanuii)、英诺克李斯特菌(L.innocua)、威尔斯李斯特菌(L.welshimeri)、西尔李斯特菌 (L.seeligeri)、格氏李斯特菌(L.grayi)、默氏李斯特菌 (L.murrayi)，但单增李斯特菌是唯一引起人类致病的李斯特菌。

单增李斯特菌的易感人群主要是儿童、老年人、孕妇和慢性病患者等免疫力较差人群，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都曾被证实是李斯特菌的感染源，而且该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品如乳制品中威胁人类健康的主要病原菌之一。因此很多国家都已经采取措施来控制食品中的单增李斯特菌，并制定了相应的标准。

目前检测单增李斯特菌的方法主要有：平板培养法、免疫学方法和分子生物学方法。平板培养法是我国的国标方法，结果可靠，操作相对简单，但过程复杂，耗时很长。免疫学检测方法主要是基于抗原抗体特异性反应而实现对待检测物进行检测的，具有灵敏度高、操作简单、检测时间快、处理样品多的特点。分子生物学方法分子检测方法是基于脱氧核糖核酸（DNA）聚合酶链式反应（PCR）建立起来的，目前的检测方法已具有快速、灵敏、特异性好、自动化程度高的特点。然而分子生物学方法依赖于检测仪器、对操作人员要求较高，因此检测成本相对较高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以特异性检测单增李斯特菌而不对李斯特菌属内其它菌有交叉反应的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

本发明的技术方案，一株单增李斯特菌单克隆抗体杂交瘤细胞株，其分类命名为单克隆细胞株A号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9301。

所述菌株的制备基本步骤为：

（1）免疫原的制备与鉴定：偶联剂SMCC先通过琥珀酰亚胺酯与载体蛋白的氨基相连，随后人工合成的N端修饰色氨酸（Cys）单增李斯特菌P60蛋白多肽peptide D (PepD：QQQTAPKAPTE）通过色氨酸的巯基与载体蛋白上马来酰亚胺基团反应，透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过电泳图鉴定；

（2）小鼠的免疫：单增李斯特菌特异性多肽完全抗原与等体积的弗氏佐剂（Freundadjuvant，Sigma），混合均匀后，通过皮下注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫使用弗氏完全佐剂，随后的3次加强免疫使用弗氏不完全佐剂；

（3）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，通过有限稀释法对阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株：单克隆细胞株A号；

（4）杂交瘤细胞株性质的鉴定：抗体亚型的鉴定采用小鼠单克隆抗体亚型试剂盒方法。

所述菌株单克隆细胞株A号分泌产生的单增李斯特菌单克隆抗体，其由单增李斯特菌单克隆抗体杂交瘤细胞株单克隆细胞株A号所分泌产生。利用其能够特异性检测单增李斯特菌的特点，应用于单增李斯特菌分析检测。

本发明的有益效果：本发明获得的单增李斯特菌单克隆抗体细胞株A号可以特异性识别单增李斯特菌在培养上清中分泌的P60蛋白，而不对李斯特菌属内其它菌分泌的P60蛋白有交叉反应。也不对其它重要的食源性致病菌，如E.coli O157、沙门氏菌、空肠弯曲菌等有交叉反应。

生物材料样品保藏：上述小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株单克隆细胞株A号，已于2014年5月 28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.9301。

附图说明

图1、多肽-SMCC-BSA免疫原的电泳表征图。1、BSA，2、BSA-SMCC（1︰40），3、BSA-SMCC-LM多肽（1︰40︰20），4、BSA-SMCC-LM多肽（1︰40︰40）。

具体实施方式