[发明专利]牛布鲁菌外膜蛋白Omp22、编码基因及其克隆方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因，尤其是涉及一种在牛布鲁氏菌(Bovine brucellosis)外膜上表达的外膜蛋白(outer membrane protein，Omp)及其基因与基因克隆方法及其应用。

背景技术

布鲁氏杆菌病(brucellosis)简称布病，又称地中海弛张热，马耳他热，波浪热或波状热，是由布鲁氏菌引起的人畜共患性全身传染病。属于我国的二类传染病。布病流行范围广，持续时间长，不但严重威胁人类健康和畜牧业生产，同时也造成了巨大的经济损失和严重的公共卫生问题。中国每年牛、羊、猪感染有百万头之多，所造成的经济损失可达十几亿元。布病是建国以来一直困扰中国畜牧业发展和人民健康的长期问题，是人医和兽医共同防御的重要疾病。世界各国都将其列为重点疾病加以防治，国际动物卫生组织规定该病为各国必须报告的疫病。随着我国与世界贸易组织的接轨和人们生活水平提高，控制和消灭布病在畜牧业工作越来越显得重要。在乳业工业领域，生产人员的感染事件导致产品批量废弃回收，对生产商造成严重的经济损失，布鲁氏菌病的危害尤其备受关注。

为了有效遏制布鲁氏菌病对奶牛业的影响，确保公共卫生安全，加强对奶牛布鲁氏菌病的综合防治和疾病监测的工作就显得极为重要。定期检疫是奶牛场进行布鲁氏杆菌病的防治和净化的重要措施。而布鲁氏菌病的检测方法是影响布鲁氏菌病检疫效果的重要因素。目前国内普遍采用的方法是：虎红平板凝集试验初次筛选，然后利用试管凝集试验进行最终定性，而国际上采用的初次筛选的方法主要有：间接酶联免疫吸附试验(I-ELISA)和荧光偏振试验。虎红平板凝集试验特异性不高，受试验温度、凝集时间相对较短和人为主观因素的影响，不易准确判定结果，只能作为初筛；而试管凝集试验是我国布鲁氏菌病的法定检测判定方法，但是该方法操作繁琐、费时，不适于现场采用，也受人为主观因素的影响。OIE标准规定采用ELISA和荧光偏振作为布氏杆菌病的国际贸易初步诊断方法。ELISA和荧光偏振方法检测监测的敏感性和特异性好，反应时间短，避免了人为因素的干扰，易标准化和质量控制，但这两种方法也只能用于初筛。荧光偏振试验由于其更为突出的特异性、敏感性和高效性，但是对操作者技术水平要求较。当前布病的监测和防治工作期许一种更加简便、高效的监测工具和治疗方法，因此探讨动物布鲁氏菌病的新的保护性抗原和免疫机制，诱导高水平的体液和细胞免疫，提高布鲁氏菌病的检测和感染病情控制水平，降低畜牧业的经济损失成为畜牧业急需解决的课题。

研究人员发现布鲁氏菌病难控制，就是因为布鲁氏菌能够逃避宿主的免疫识别。随着病原菌的进化，它们需要必要的毒力因子来侵入宿主，并在宿主体内增殖。外膜蛋白是布鲁氏菌的主要免疫原和保护性抗原。为了更精确的疫苗免疫，控制与治疗布鲁氏菌病，寻找蛋白性质的诊断原和免疫原具有重要的意义。国外的研究工作已对一些布鲁氏菌的外膜蛋白进行了免疫原性和保护性的研究。

目前根据分子质量的大小，将布鲁氏菌外膜蛋白分为3组。第一组有外膜蛋白10k、18k、19k，其中Omp10、Omp16和Omp19为一种脂蛋白。第2组包括36k～38k外膜蛋白。第3组包括31k～34k外膜蛋白和25k～27k外膜蛋白，Omp25和Omp31与布鲁氏菌的毒力和免疫原性有密切关系。Omp22基因的突变株，阴血清反应的敏感性增强，且在稳定期生长困难，这些都有可能与Omp22基因变异株的毒力减弱有关。研究发现Omp22免疫原性较强，可诱导免疫实验动物产生高滴度特异性抗体Omp22编码基因和纯化蛋白成为布病的诊断和预防的更为首选的标志物，同时可以作为潜在的药物靶点，能够在机体保护性免疫反应中起到重要的作用。但是目前布鲁氏菌菌外膜蛋白Omp22序列的应用研究甚少，关于牛的布鲁氏菌外膜蛋白Omp22未见报道，极大限制了作为乳业经济动物的奶牛病害的监测和防治。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种牛布鲁氏菌外膜蛋白Omp22及其编码基因和编码基因的克隆方法、克隆重组菌株及其应用。本发明在牛布鲁氏病菌致病机制的深化研究、疾病防治及进一步开发为医药产品和畜牧业诊断产品方面具有良好的应用前景，并为动物健康状态的监测奠定基础。

本发明可产生牛布鲁菌外膜蛋白Omp22的编码基因的克隆载体和转化菌株，其为牛布鲁菌重组菌株(Bovine brucellosis recombination strain)PGEM-7Zf-omp22，其具有复制如序列<400>4的核苷酸序列的能力。

为了实现上述目的，本发明的解决方案是：