[发明专利]一种全细胞催化产乳果糖的方法

权利要求书

1.一株异源表达纤维二糖差向异构酶的基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的纤维二糖差向异构酶。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌是E.coli BL21(DE3)，以pET-28a(+)为表达载体。

3.一种诱导权利要求1所述基因工程菌表达纤维二糖差向异构酶的方法，是利用IPTG或乳糖诱导重组大肠杆菌发酵产纤维二糖差向异构酶。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以构建好的产纤维二糖差向异构酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)作为生产菌株，经活化、扩大培养至对数期OD₆₀₀＝0.2-2.0时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度0.05-1.2mM或者加入乳糖至终浓度为0.5-50g/L，15-45℃，150-250r/min摇床培养8-24h，离心收集菌体，获得表达了纤维二糖差向异构酶的重组大肠杆菌。

5.一种应用权利要求1所述基因工程菌全细胞催化产乳果糖的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)以乳糖诱导培养重组E.coli BL21(DE3)产纤维二糖差向异构酶；(2)收集培养得到的菌体通过乙醇透化、真空冷冻干燥处理作为细胞生物催化剂；(3)将细胞生物催化剂直接用于转化乳糖生产乳果糖。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)将1L发酵液中离心收集到的菌体悬浮于1-100mL1-90％的乙醇中，4-30℃下混匀5-120min，离心收集沉淀，经真空冷冻干燥得到的菌粉4℃条件下保存，菌粉作为细胞生物催化剂直接用于转化乳糖生产乳果糖。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括以下步骤：

①将乳糖以缓冲液配制成50-800g/L，调节pH至6.0-9.5作为底物溶液；

②将细胞生物催化剂加入底物溶液，转化条件为：底物乳糖浓度50-800g/L，生物催化剂以冻干菌粉的酶活计对底物溶液的用量为1-100U/mL，初始pH6.0-10.0，反应温度为40-95℃，反应时间为1-24h。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，底物溶液是以Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、PIPES缓冲液、Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、Britton-Robinson缓冲液或水中的一种作为溶剂。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)在Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、PIPES缓冲液、Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、Britton-Robinson缓冲液或水中进行。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，底物乳糖浓度为600g/L，菌粉添加量为12.5U/mL，反应温度为80℃，反应时间3h，pH7.5。