[发明专利]一种筛选CCR4拮抗剂的细胞模型及筛选方法

权利要求书

1.一种细胞，其同时稳定表达CCR4蛋白和报告基因蛋白，其中：

所述细胞为人骨肉瘤U2OS细胞；

所述CCR4蛋白和报告基因蛋白以融合蛋白形式表达；

所述CCR4为人源；

所述报告基因蛋白为EGFP蛋白；并且，

所述细胞的保藏编号为CGMCC No.9003，保藏日期2014年3月26日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.一种筛选CCR4拮抗剂的方法，包括下述步骤：

(1)接种和培养：将权利要求1所述的细胞以一定密度接种至适宜的培养基中，培养1－48小时；

(2)加样：分别加入CCR4激动剂、或待测样品和CCR4激动剂的混合物，并继续培养一定时间；

(3)检测CCR4的分布：以加入CCR4激动剂的细胞为参照，检测加入待测样品和CCR4激动剂的混合物的细胞中CCR4的分布是否受到了抑制。

3.根据权利要求2所述的筛选方法，其包括以下步骤：

(a)接种和培养：将权利要求1所述的细胞以一定密度接种至适宜的培养基中，培养1－48小时；

(b)弃培养基，用缓冲液洗细胞1次或多次；

(c)加样：分别加入CCR4激动剂、或待测样品和CCR4激动剂的混合物，并继续培养一定时间；

(d)用PBS稀释的甲醛溶液固定细胞；对细胞核进行染色；

(e)检测CCR4的分布：以加入CCR4激动剂的细胞为参照，检测加入待测样品和CCR4激动剂的混合物的细胞中CCR4的分布是否受到了抑制。

4.根据权利要求2或3所述的筛选方法，步骤(1)或(a)中，细胞接种的密度为1.0×10⁴－10.0×10⁵个/ml。

5.根据权利要求2或3所述的筛选方法，步骤(1)或(a)中，细胞接种的密度为6.0×10⁴－10.0×10⁴个/ml。

6.根据权利要求2或3所述的筛选方法，步骤(1)或(a)中，培养时间为12－36小时。

7.根据权利要求2或3所述的筛选方法，步骤(1)或(a)中，培养时间为24小时。

8.根据权利要求2或3所述的筛选方法，步骤(1)或(a)中，培养容器为黑色透底的培养板。

9.根据权利要求2或3所述的筛选方法，步骤(1)或(a)中，培养容器为黑色透底的96孔培养板。

10.根据权利要求2或3所述的筛选方法，步骤(1)或(a)中，培养条件为37℃、5％CO₂、80％湿度。

11.根据权利要求2或3所述的筛选方法，步骤(1)或(a)中所用培养基为含有500μg/mLG418的DMEM培养基。

12.根据权利要求3所述的筛选方法，步骤(b)中，所述缓冲液为HBSS缓冲液。

13.根据权利要求2或3所述的筛选方法，步骤(2)或(c)中，培养条件为37℃、5％CO₂、80％湿度。

14.根据权利要求2或3所述的筛选方法，步骤(2)或(c)中，所述CCR4激动剂为TARC和/或MDC。

15.根据权利要求2或3所述的筛选方法，步骤(2)或(c)中，所述CCR4激动剂的终浓度为0.03μg/ml－1μg/ml。

16.根据权利要求2或3所述的筛选方法，步骤(2)或(c)中，继续培养的时间为1－60分钟。