[发明专利]猪CD40Ldimer融合蛋白及其编码基因

说明书

技术领域

    本发明属于生物技术制药工业中基因工程领域，具体是一种猪CD40Ldimer融合蛋白及其编码基因。

背景技术

CD40配体（CD40L、CD154），属于TNF家族的一员，是一个II型跨膜糖蛋白，主要表达在活化的CD4⁺ T细胞、一小部分CD8⁺ T细胞和血小板上。CD40L可能以异源二聚体复合物的形式表达，并被金属蛋白酶从跨膜蛋白上分离下来。可溶性CD40L像细胞因子一样与CD40结合后传递生物信号。CD40和CD40L的相互作用可以激活抗原呈递细胞和T细胞，转化抗体亚型，并促进生发中心形成。此外，它们能够活化细胞毒性T细胞，降低免疫抑制，调节肿瘤细胞的生存并将与肿瘤相关性抗原呈递给免疫系统。

CD40-CD40L的相互作用在获得性免疫中的重要作用表明，CD40L有可能作为一个潜在的疫苗佐剂来提高疫苗的免疫效果。将CD40L作为疫苗佐剂应考虑其生产成本和生产水平，但从组织提取和化学合成的方法获得CD40L的成本高且产量低，不能满足其作为疫苗佐剂的需求。

发明内容

本发明为了解决从组织提取和化学合成的方法获得CD40L的成本高且产量低，不能满足其作为疫苗佐剂的需求的问题，提供了一种猪CD40L融合蛋白及其编码基因。

本发明是通过以下技术方案实现的：猪CD40Ldimer融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述猪CD40Ldimer融合蛋白的编码基因，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明所述融合蛋白的编码基因是由猪CD40Ldimer的cDNA序列、6个组氨酸cDNA序列和限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ位点的cDNA序列以及符合酵母表达偏好性的基因序列组成。

本发明所述猪CD40Ldimer融合蛋白的制备过程如下：

表达载体的构建：人工合成CD40Ldimer的基因序列作为第一部分，以合成的CD40Ldimer基因序列为PCR模板，通过PCR扩增获得第二部分基因序列，将第一步和第二部分连接后再与表达质粒pwPICZalpha进行连接，通过双酶切检测和筛选含有CD40Ldimer基因序列的表达载体；

酵母表达系统的构建：使用限制性内切酶线性化重组表达质粒，通过电转化的方法，将CD40Ldimer的基因序列整合到酵母的基因组中。将转化后的菌体悬液涂布于含有Zeocin的YPD平板上，30℃培养3-4d；挑取6个单菌落，进行小剂量的诱导表达，SDS-PAGE检测表达上清确认阳性克隆；

重组蛋白的纯化和结合能力的检测：挑选阳性克隆菌落进行大剂量的诱导表达，表达上清采用ProteinPure Ni-NTA 树脂和强阳离子交换树脂纯化，通过SDS-PAGE和Western blot检测纯化的重组蛋白。利用BCA测定浓度，计算CD40Ldimer的产量；通过ELISA检测重组CD40Ldimer的结合能力，证明其构象的正确性。

本发明所述的所述的猪CD40Ldimer融合蛋白利用Pichiapastoris高效的外源蛋白表达、易于大规模培养、培养基价格低廉、易纯化并能够对表达的蛋白进行转录后修饰等优点，以Pichiapastoris表达重组可溶性猪CD40Ldimer，为其作为疫苗佐剂的研究提供充足的原材料。

附图说明

图1 是ProteinPure Ni-NTA 树脂纯化CD40Ldimer的SDS-PAGE电泳图。

图2 是强阳离子交换树脂纯化CD40Ldimer的SDS-PAGE电泳图。

图3 是重组CD40Ldimer的Western blot分析图。

图4 是重组CD40Ldimer的ELISA分析图。

具体实施方式

1、所用试剂及其配制

（1）LB（Luria-Bertani）液体培养基：取蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl5g，溶解于800mL ddH₂O中，10M NaOH调节pH至7.0，定容至1000mL，高压灭菌（121℃，1.034×10⁵Pa）20min，4℃保存。

（2）LB（Luria-Bertani）固体培养基：按每1000mL ddH₂O加15g琼脂粉，向LB液体培养基中加入琼脂粉，高压灭菌，4℃保存。

（3）贮备液：