[发明专利]猪抗菌肽NK-lysin融合蛋白及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术制药工业中基因工程领域，具体是一种猪抗菌肽NK-lysin融合蛋白及其编码基因与应用。 

背景技术

    到目前为止，癌症的发生率以及死亡率都在急剧攀升，虽然在癌症研究付出了巨大的代价，但是由于诸多的原因给癌症的治疗带来了巨大的困难。其中传统化疗药物的广泛使用导致的多重耐药性的问题是主要原因之一，另外，化疗药物也存在严重的副作用。近年研究发现，一些抗菌肽除了抗微生物的活性外，对肿瘤细胞也具有杀灭作用。抗菌肽是生物体内产生的一类具有生物学活性的小分子多肽，存在于多种生物体中，是宿主免疫防御系统的一个重要组成部分，具有广谱抗菌、无耐药性及毒副作用等优点，由于抗菌肽特殊的作用机制，使得病原微生物和肿瘤细胞不容易对其产生耐药性。随着研究的不断深入，越来越显示出了其在医学、兽医学等相关领域的独特应用价值。NK-lysin由78个氨基酸残基组成，属于鞘脂激活蛋白样蛋白家族，是由自然杀伤细胞和T淋巴细胞分泌表达的一种具有抗微生物和抗肿瘤活性的多肽。NK-lysin蛋白对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、原生动物寄生虫和肿瘤细胞都有溶解活性。将NK-lysin蛋白作为一种抗癌药物进行开发和利用将产生很高的经济价值和巨大的社会效益，但采用提取或合成的方法生产NK-lysin蛋白的工艺复杂，获取量少，且成本较高，无法满足市场需求，提高NK-lysin蛋白产量是一个急需解决的问题。 

发明内容

本发明利用猪抗菌肽NK-lysin和Pichiapastoris的优点，提供了一种猪抗菌肽NK-lysin融合蛋白及其编码基因与应用。 

本发明是通过以下技术方案实现的：猪抗菌肽NK-lysin融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。 

所述猪抗菌肽NK-lysin融合蛋白在制备抑制肿瘤细胞药物中的应用。 

所述猪抗菌肽NK-lysin融合蛋白的编码基因，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。 

所述猪抗菌肽NK-lysin融合蛋白的编码基因是由编码猪NK-lysin成熟肽的cDNA序列、6个组氨酸cDNA序列和限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ位点的cDNA序列以及符合酵母表达偏好性的基因序列组成的。 

本发明所述猪抗菌肽NK-lysin融合蛋白的制备方法为： 

表达载体的构建：人工合成的NK-lysin的基因序列上设计有限制性内切酶的酶切位点，将NK-lysin的基因序列和表达质粒pwPICZalpha用同样的限制性内切酶酶切后连接在一起，通过双酶切检测和筛选含有NK-lysin的基因序列的克隆；

酵母表达系统的构建：使用限制性内切酶线性化重组表达质粒，通过电转化的方法，将NK-lysin的基因序列整合到酵母的基因组中；将转化后的菌体悬液涂布于含有Zeocin的YPD平板上，30℃培养3-4d；挑取6个单菌落，进行小剂量的诱导表达，SDS-PAGE检测表达上清确认阳性克隆；

重组蛋白的纯化和活性检测：挑选阳性克隆菌落进行大剂量的诱导表达，表达上清采用ProteinPure Ni-NTA 树脂和强阳离子交换树脂纯化，通过SDS-PAGE和Western blot检测纯化的重组蛋白；利用BCA测定浓度，计算NK-lysin重组蛋白（融合蛋白）的产量。

本发明所述的猪抗菌肽NK-lysin融合蛋白很好地利用了抗菌肽和Pichia pastoris的优点，其编码基因可以在Pichia pastoris中高效表达，降低了抗菌肽的生产成本，将此融合蛋白在制备抑制肿瘤细胞药物中的应用，是一种优良的抗癌药物，具有很高的经济价值和巨大的社会效益。 

附图说明

图1 是ProteinPure Ni-NTA 树脂纯化NK-lysin的SDS-PAGE电泳图。 

图2 是强阳离子交换树脂纯化NK-lysin的SDS-PAGE电泳图。 

图3 是重组NK-lysin的Western blot分析图。 

图4 是重组NK-lysin的杀伤肿瘤细胞的分析图。 

具体实施方式

1、所用试剂及其配制 

（1）LB（Luria-Bertani）液体培养基：取蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl5g，溶解于800mL ddH₂O中，10M NaOH调节pH至7.0，定容至1000mL，高压灭菌（121℃，1.034×10⁵Pa）20min，4℃保存。