[发明专利]禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种DNA疫苗，具体的说是禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法。

背景技术

禽多杀性巴氏杆菌病，是由禽多杀性巴氏杆菌引起的主要侵害鸡、火鸡、鸭、鹅等家禽和野禽类的一种接触性败血性传染病, 以发热、腹泻、呼吸困难为特征，最急性病例死亡迅速。是严重影响我国养禽业发展的主要细菌病之一，也是一种目前尚无很好的预防方法而又造成重大经济损失的禽类疾病。

目前我国用于预防禽多杀性巴氏杆菌病的商业化疫苗主要有弱毒活疫苗和灭活疫苗两种，其中弱毒活疫苗是我国所有禽类传染病弱毒活疫苗中研究最多的一类。该类疫苗虽然能在一定程度上预防该病的发生，但也存在安全性较差，副作用偏大等问题，应用不当甚至可能引起禽多杀性巴氏杆菌病的爆发。而禽多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的免疫效果尚且不如弱毒活疫苗，所以必需研制更加有效的禽多杀性巴氏杆菌病疫苗以预防该病。

发明内容

本发明针对上述问题提供了一种可用于预防禽多杀性巴氏杆菌病的禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法，该疫苗制备方法较为简单，操作方便，以该方法制备的疫苗能够有效的防止禽多杀性巴氏杆菌病对鸡的伤害。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是：

禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法，其具体制备方法包括以下步骤：

步骤一、禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因的获得

(1)、根据禽多杀性巴氏杆菌的基因组序列设计用于扩增ptfa基因的两条引物PL和PU，其基因序列如序列表序列1和序列2：

PU：5′-TGCggattcATGAAAAAAGCCATTTTC-3′

PL：5′-TGACCTCGAGtTATGCGCAAAATCCT-3′；

(2)、向PCR反应管中依次加入PU和PL引物各1微升、浓度为100-200pmol/ml的禽多杀性巴氏杆菌基因组水溶液1微升、ddNTPs 2.5微升、Taq DNA聚合酶1微升、PCR反应缓冲液2微升和水11.5微升，混合均匀后进行PCR反应，PCR反应结束后，产物中禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因的基因序列如序列表序列3；

所述PCR反应程序为：首先95℃预变性3分钟，然后进入循环程序，循环程序为94℃变性1分钟，53℃复性30秒，72℃延伸30秒，将上述循环程序重复25次后再以72℃终延伸5分钟结束PCR反应。

(3)、向上述装有禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因的PCR反应管中依次加入限制性核酸内切酶BamHⅠ和XholⅠ各3微升、限制性核酸内切酶缓冲液4微升和水3微升，混合均匀后将PCR反应管放置于37℃的水浴锅中反应6小时，取出后再放入65℃的水浴锅中5分钟以结束反应，产物为酶切后禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因，将其保存于-20℃条件下，备用；

步骤二、pcDNA3.1(+)质粒的处理

向0.5毫升的离心管中依次加入pcDNA3.1(+)质粒5微升、限制性核酸内切酶BamHⅠ和XholⅠ各2.5微升、限制性核酸内切酶缓冲液2微升和水8微升，混合均匀后将离心管放置于37℃的水浴锅中反应5小时，取出后再放入65℃的水浴锅中5分钟，得到处理后的pcDNA3.1(+)质粒，备用；

步骤三、禽多杀性巴氏杆菌ptfa重组质粒的制备

(1)、依次向0.5毫升的离心管中加入处理后的pcDNA3.1(+)质粒1微升、酶切后禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因7微升、T4 DNA连接酶1微升和T4 DNA连接酶缓冲液1微升，混合均匀后将离心管放置于16℃的水浴锅中反应8小时，取出备用；

(2)、将上述备用的0.5毫升离心管中的液体移入1.5毫升的离心管中，再加入100微升大肠杆菌JM83，混合均匀后依次放置于0℃条件下30分钟、42℃条件下1分钟和0℃条件下2分钟，然后向离心管中加入0.8毫升的大肠杆菌液体培养基，混合均匀后放置于37℃的恒温摇床中以180转/分钟的转速振荡培养1小时，培养结束后将离心管以2000转/分钟的转速离心1分钟，倒掉上清液，再向其中加入0.1毫升无菌水，将悬浮起来的沉淀吸出，并涂布于含浓度为60微克/毫升氨苄青霉素的固体培养平板上，倒置于37℃的恒温培养箱内培养12小时；