[发明专利]猪骨骼肌特异性表达基因MyoG启动子的克隆及应用

说明书

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及到猪骨骼肌特异性表达基因MyoG启动子区域的分离鉴定及功能验证。

背景技术

真核生物的生存及生长发育有赖于基因组内成千上万个基因的表达以及进行正常的调控作用。经过科研人员多年的努力探索，我们现在认识到每一个基因的表达都受到多种不同机制的调控。而对启动子的分析可以帮助我们了解真核生物转录调控机理里最基本的信息。这些基础知识也是现代分子生物学基础理论重要的组成部分。其次，因为在基因的转录激活过程中发生的一系列级联反应最终都会作用到启动子上，都会对启动子上发生的基础转录调控作用造成直接或间接的影响。

启动子常常被描述为有两个独立的部分，即核心启动子和扩展的启动子区域，核心启动子一般位于转录起始位点上游50bp之内，是转录起始复合物形成和通用转录因子聚集的位置。而在扩展的启动子区域内包含有特异的调控序列，控制下游基因的时空表达模式(Butler and Kadonaga 2002)。启动子分类方法较多，根据启动子的功能及作用方式可以分为组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。组织特异性启动子能够启动外源基因仅在受体所需要的部位特异表达，克服了组成型启动子启动的外源基因在受体中非特异、持续、高效表达所造成的浪费，增加转基因的效果(Smith,Sumazin et al 2007)。

除了非特异性蛋白在不同的组织中非特异表达会带来安全问题和潜在的毒性作用外，由病毒驱动的启动子所控制的重组蛋白表达还会带来免疫反应，而那些以特异性方式表达的产物只会在特定的组织和特定的细胞中表达，不会出现上述问题(Cordier et al 2001,Hartigan-O'connor et al 2001,Hauser et al 2000)。组织特异性启动子通常以特定的组织细胞结构和化学、物理信号为基础，可对外源基因进行靶向定位，将基因固定于某一组织或细胞中表达，减少了机体能量和物质的损耗及对机体代谢活动的影响，同时又能够起到定向改善某一组织特性的效果，这在人类疾病治疗方面的前景尤其可观。其次，转基因动物育种研究中，通过组织特异性启动子调控外源目的基因在靶组织中表达，能够有效改善动物的某些性状，如肌内脂肪；或改善动物的消化系统以减少排泄物中的氮磷含量等。鉴于此，组织特异性启动子在基因工程和转基因育种中越来越受到研究者的青睐。

肌细胞生成素(myogenin,MyoG)是生肌决定因子基因家族中唯一的在所有骨骼肌细胞系均可表达的基因，其功能不可被其它生肌调节因子所代替。肌肉细胞有自己的内在转录程序建立联系，而且这个网络在某种程度上是由MRFs、MEF-2所控制的。

NCBI数据库中已含有人、鼠、猪、鸡、斑马鱼等MyoG基因的序列。研究者可以利用数据库获得MyoG基因的启动子序列。Anne-Sophie Armand等2008年获得小鼠MyoG5′-侧翼序列600bp，构建含有双荧光素报告载体，利用C2C12细胞系，检测其活性，并在RNA水平以及蛋白质水平检测其基因表达量，发现细胞在分化96h时MyoG启动子活性达到最大(Armand et al 2008)。宋兴超等克隆甘肃马鹿MyoG启动子序列685bp，并与人、猪、小鼠启动子序列进行比对，相似性分别为84.9％、88.1％和82.6％(宋兴超2009)。王秋华等克隆日本和牛MyoG启动子序列，构建一些列启动子缺失片段，利用牛肌源干细胞和牛胎儿成纤维细胞，检测启动子活性，确定转录起始位点上游1039bp的启动子活性最高(王秋华2012)。刘铮铸等扩增波尔山羊MyoG基因的5′-侧翼序列969bp，并对其进行序列分析及结构预测，通过序列比对，此序列与牛、小鼠、马鹿和人物种的序列相似性在37.22％-96.85％之间；但与其它物种不同的是，波尔山羊序列MyoG启动子的GC含量高达50.6％(刘铮铸2012)。

MyoG基因是骨骼肌分化所必需的因子，在肌细胞分化为肌管的过程中起重要作用。Lucarelli等发现小鼠MyoG5′-侧翼区-1092bp～-134bp中有一段富含胞嘧啶的序列，这段序列含有CCGG位点，肌肉细胞分化过程中此位点能够结合与分化相关的转录因子，调节启动子的甲基化模式(Lucarelli et al 2001)。Fuso等发现，在细胞分化时，此段序列的甲基化状态处于动态变化，当细胞处于未分化状态时，此序列的甲基化约为50％，随着细胞分化时间的延长，启动子序列的甲基化百分数出现先降低后增加的现象(Fuso et al 2010)。