[发明专利]一种优化的植物病毒接种方法

说明书

技术领域

本发明属于植物保护和植物病毒基因工程领域，提供了一种优化的植物病毒接种方法，具体是一种利用农杆菌大规模接种病毒的方法。

背景技术

通过基因工程手段，可以构建植物病毒的侵染性cDNA克隆，进而利用反向遗传学技术明确调控病毒致病力的分子机制，由此获得的弱毒株系可作为弱毒疫苗用来保护植株免受强毒株系的危害；也可以把病毒的侵染性cDNA克隆改造成植物表达载体，用来生产动物疫苗、抗病毒蛋白等高附加值的外源蛋白。

限制植物病毒弱毒疫苗和表达载体应用的一个重要瓶颈是目前没有适合在田间大规模接种的技术。根据不同植物病毒侵染性克隆的特点，可以通过基因枪接种，摩擦接种或是农杆菌浸润等方法接种供试植物。基因枪接种需要昂贵的实验器材，操作复杂，每批次可接种的植株数量极少。摩擦接种和农杆菌浸润不需要复杂的仪器，但每批次可接种的植株数量也非常有限。这些方法只适合在实验室内应用，不能满足田间大规模接种的需要。

因此，生产中急需开发简便高效、适合植物病毒弱毒疫苗与表达载体大规模接种的方法。

发明内容

针对现有接种方法无法满足植物病毒弱毒疫苗与表达载体田间大规模接种需要这一问题，本发明提供了一种优化的适合田间大规模接种需要的病毒接种方法。

本发明主要是针对能在农杆菌中复制的侵染性克隆，利用了农杆菌在自然界可以通过自然孔口和伤口侵入植物这一现象，以接种细菌的方式来接种病毒。其包括如下步骤：将植物病毒弱毒疫苗与植物病毒表达载体转化农杆菌，经过培养后离心收集菌体，重悬后稀释到一定浓度，通过叶片喷雾的方式将菌体喷布到植物叶片表面。农杆菌可以通过自然孔口(例如气孔)和微伤口侵染植物，从而将病毒基因组带入植物细胞，使病毒在植物细胞内增殖并形成系统侵染。

本发明实施的具体技术方案是：将待接种病毒的侵染性克隆转化农杆菌，培养后离心收集农杆菌菌体，将其稀释到OD₆₀₀值为0.2-0.3，通过叶面喷施农杆菌接种植物病毒。接种烟草的最佳时期为四叶一心期至六叶一心期。

本方法操作简单、成本低、效率高，不需要特殊的仪器设备，适合在科研温室、育苗公司的育苗棚或大田应用，可在短时间内接种大量植株。

附图说明

图1采用本发明方法接种烟草脉带花叶病毒侵染性克隆pCamTVBMV-GFP15天后普通烟的症状(A)及绿色荧光蛋白表达情况(B)

图2利用本发明在普通烟三叶一心期喷雾结果示意图

图中A为接种后第六天，在紫外灯下可见普通烟叶片出现零星荧光斑点；B为接种后第七天，荧光斑点数目增加；C为接种后第八天，荧光斑点面积逐渐矿大，病毒通过叶脉向其它部位扩展；D为接种后第十天，普通烟上部叶片布满绿色荧光。

图3利用本发明在普通烟四叶一心期喷雾结果示意图

图中A、B、C、D分别为接种后第六天、第七天、第八天和第十天，病毒在普通烟植株上的扩展情况。

图4利用本发明在普通烟六叶一心期喷雾结果示意图

图中A、B、C、D分别为接种后第六天、第七天、第八天和第十天，病毒在普通烟植株上的扩展情况。

图5利用本发明接种的弱毒株系DDK对强毒株系的交叉保护效果

图中A为先用喷雾法接种弱毒株系然后再接接种强毒株系的植株，几乎看不到症状；B为直接接种强毒株系的植株，产生严重的花叶症状。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1：证明农杆菌喷雾可系统侵染普通烟并表达外源蛋白(以绿色荧光蛋白GFP为例)

1.病毒侵染性克隆转化农杆菌

从-80℃冰箱中取出一管农杆菌GV3101的感受态细胞(100-200μl)，冰上解冻。解冻后加入100-300ng病毒侵染性克隆pCamTVBMV-GFP质粒。放入液氮中冷冻1-5min，取出后立即放入37℃水浴中5min。

加入800μl无抗生素的LB培养液，28℃摇床培养3h。5000r/min离心收集菌体，离心管中保留约200μl培养液并重新悬浮菌体。

在超净台上将菌体均匀涂布于含抗生素(本实验中为卡那霉素、利福平霉素和四环素)的固体培养基平板，28℃培养2天，直至出现菌落。挑取单菌落进行PCR鉴定，证明菌落中含有病毒侵染性克隆pCamTVBMV-GFP。