[发明专利]棉花抗线虫基因GhNtR1及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因克隆以及功能分析，提供了一个棉花抗线虫相关基因，属于植物基因工程领域。用于通过植物基因工程技术改善植物抗病性和其他有益生产性状。 

背景技术

根结线虫(Meloidogyne spp)是危害农作物的重要病原生物，目前国际上报道的根结线虫有80多种，我国报道的根结线虫有29种。由根结线虫引起的农作物损失中90％以上是由南方根结线虫(M.incognita)、花生根结线虫(M.arenaria)、爪哇根结线虫(M.javanica)、北方根结线虫似(M.Hapla)4种主要根结线虫引起的。植物根结线虫对农业生产造成了巨大的危害，特别是随着温室大棚的大面积推广，为根结线虫的发生、发展提供了适宜的环境，使得土壤中的根结线虫得以积聚繁殖，温室蔬菜受害尤为严重，且病害呈逐年上升之势。目前对于根结线虫仍然缺乏安全有效的防治措施，从抗性资源中发掘抗性基因(R基因)，并利用生物技术手段培育抗性品种是最有前景的抗根结线虫研究方向。 

Hs1Pro-1是第一个克隆的抗胞囊线虫基因，对甜菜包囊线虫具有抗性。该基因编码一个由282个氨基酸组成的酸性蛋白质，具有几个富含亮氨酸区域(1eucine rich repeat，LRR)构成的受体结构域和一个典型的跨膜区域，是位于细胞膜上的糖蛋白受体。另外大豆胞囊线虫抗性基因rhg1和Rhg4也是受体类似蛋白激酶(Receptor like kinase)。 

除了Hs1pro-1，rhg1和Rhg4外，其它克隆的线虫抗性基因都属于NBS-LRR基因家族。如小麦的禾谷孢囊线虫抗性基因Cre3；马铃薯的胞囊线虫抗性基因Gpa2,Gro1-4；醋栗番茄(S.pimpinellifolium)中白线虫(G.pallida)金线虫(G.rostochiensis)抗性基因Hero A和番茄的Mi-1基因。Mi-1基因对南方根结线虫，花生根结线虫和爪哇根结线虫都具有抗性，但对北方根结线虫无效，并且在温度高于28℃时抗性丢失。Mi-1基因的特征表现为在寄主植物中引起过敏反应(HR)，即在二龄侵染性幼虫头部周围植物细胞发生局部坏死。国外从20世纪40年代开始开展对Mi-1基因的研究，目前该基因在欧洲和美国被广泛应用于番茄上控制根结线虫的危害,并取得了良好的效果)。在番茄中又陆续发现了8个新的线虫抗性基因。Mi-2、Mi-3、Mi-4、Mi-5、Mi-6、Mi-9在32℃下对根结线虫仍具有较高的抗性。除 了Mi-1外，另一个克隆的根结线虫抗性基因是樱桃李的Ma基因，该基因编码一个长为2048个氨基酸的超长NBS-LRR基因，具有广谱根结线虫抗性，对30种根结线虫具有抗性。 

棉花是世界重要的经济作物。青枯病、枯萎病、黄萎病和根结线虫等棉花病害对棉花生产造成严重危害，降低棉花产量和品质。克隆抗性基因不仅对研究棉花和病原物互作十分重要，并且可以为转基因育种提供更多的候选基因。 

发明内容

本发明的目的是：提供了一个棉花抗线虫相关基因GhNtR1，该基因编码一个CC-NBS-LRR蛋白。该基因过量表达株的线虫抗性明显增加，同时接种线虫后转基因植株的防卫反应基因PR1和PR3表达量较非转基因植株更高，并且有更明显的胼胝质积累。可以利用本发明基因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高作物抗线虫性状。 

本发明涉及植物基因克隆以及功能分析，提供了一个棉花抗病相关基因GhNtR1，属于植物基因工程领域，该基因来源于陆地棉品种常抗棉(Gossypium hirsutum L.)，是下述核苷酸序列之一： 

1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列或部份DNA序列； 

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。 

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(15mM NaCl,1mM NaH2PO4,0.1mM EDTA)、0.1×SSC(15mM NaCl,1.5mM柠檬酸钠)、0.1％SDS(十二烷基磺酸钠)的溶液中，65℃条件下洗膜。 

序列表中的SEQ ID NO.1由2989个碱基组成，自5’端第152位碱基为转录起始位点,记为+1；第2740位碱基为转录终止位点。完整编码框长度为2584个碱基，编码蛋白为861个氨基酸，分子量为93KD。GhNtR1具有保守的P-LOOF结构域，属于CC-NBS-LRR类蛋白。