[发明专利]一种长裙竹荪抑菌活性单体的分离纯化方法

说明书

技术领域    

    本发明涉及一种活性物质的分离方法，具体涉及一种长裙竹荪中抑菌活性单体的分离纯化方法。

背景技术    

    竹荪(Dictyophora indusiata )又称竹参、面纱菌、竹鸡蛋，隶属于真菌门、担子菌纲、鬼笔菌目、鬼笔菌科、竹荪属。菌裙是竹荪特有的形态特征，由海绵质组成，10cm以上的称长裙竹荪。长裙竹荪不仅营养丰富，含有多种氨基酸、维生素和矿物质，还具有健脾益胃、降血脂、降血压，抗肿瘤、抗凝血、消肿止痛、抗艾滋病、刺激免疫、抗辐射以及较强的抑菌防腐作用，是一种天然的食品防腐剂。竹荪与肉共煮，肉不易变质。我们的实验结果也表明：长裙竹荪粗提物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、肠炎沙门氏菌、李斯特菌、副溶血弧菌等细菌有很明显的抑菌效果，并且较低的浓度即可以起较好的抑菌和杀菌效果；且抑菌物质在pH5.0-8.5的弱酸至弱碱性条件下稳定，对高温高压也很稳定，这与很许多防腐剂只有在酸性条件下才能发挥防腐作用相比有很大的优势。

从长裙竹荪中分离出具有抑菌活性的单体，它可以开发成一种天然防腐剂应用于食品，具有广阔的应用前景。

发明内容    

本发明的目的是提供一种分离长裙竹荪中抑菌活性单体物质的方法，为食品提供一种安全的天然防腐剂。

    本发明的长裙竹荪抑菌活性单体的分离纯化方法，包括长裙竹荪子实体预处理、浸提、萃取、硅胶柱层析、反相硅胶柱层析，其操作步骤如下：

(1). 长裙竹荪子实体预处理：竹荪子实体干品于60℃烘箱中烘烤3h，然后用植物粉碎机粉碎，过80目筛，得到子实体粉末；

（2）. 浸提：称取长裙竹荪子实体粉末，按液固重量分数比26~24：1加入无水乙醇，72℃下水浴1.5h后抽滤得滤液，用旋转蒸发器100rpm、60℃下将液体旋干，所得固形物为长裙竹荪粗提物，备用；

（3）. 萃取：长裙竹荪粗提物溶于水，依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，每层萃取3-5次即可；取乙酸乙酯层萃取物置于旋转蒸发器上60℃下蒸干溶剂，得乙酸乙酯层固形物，备用；

（4）. 硅胶柱层析：

1）第一次硅胶柱层析：①装柱：准确称取适量200-300目硅胶于烧杯中，加入石油醚搅拌成浆，在色谱柱底端塞一团棉花，往柱中加入5mL石油醚，将浆液缓缓倾入柱中，使硅胶自然沉降，同时用玻璃棒轻轻敲击色谱柱以排除气泡，将层析柱下端开关打开，使流动相自然流下，直至液面在柱面上方约3cm，用700mL第一个流动相平衡；②上样：将试样溶于少量甲醇中，用4倍于试样的硅胶研磨混匀，挥干溶剂，使其松散，经漏斗缓缓加入色谱柱上方，然后用少量流动相淋洗柱壁，使硅胶柱表面平整；③淋洗：用石油醚：乙酸乙酯=6.5-7：2.8-3、0.8-1：0.8-1依次分别淋洗5个柱体积，两种比例淋洗液各自用量为1500 mL，用锥形瓶收集洗脱液，每瓶收集300mL，共得到10个片段，并在旋转蒸发器上50℃蒸干各个片段的液体，依次编号为D₁1-D₁10号，合并D₁2-D₁8片段的组分，备用；

2）第二次硅胶柱层析：①装柱：同1）；②上样：同1）；③淋洗：用石油醚﹕乙酸乙酯=6.5-7：2.8-3、5.6-6：3.6-4依次分别淋洗3个柱体积，两种比例淋洗液各自用量为750 mL用锥形瓶收集洗脱液, 每瓶收集250mL，共得到6个片段，并在旋转蒸发器上50℃蒸干各个片段的液体，依次编号为D₂1-D₂6号，合并D₂3-D₂4片段组分，备用；

3）第三次硅胶柱层析：①装柱：同1）；②上样：同1）；③淋洗：用石油醚﹕乙酸乙酯=7.5-8：1.8-2、7-7.5：3-3.5依次分别淋洗3个柱体积，两种比例淋洗液各自用量为750 mL，用锥形瓶收集洗脱液，每瓶收集250mL，共得到6个片段，并在旋转蒸发器上50℃蒸干各个片段的液体，依次编号为D₃1-D₃6号，合并D₃4-D₃5片段组分，备用；