[发明专利]一种快速有效地降低花生遗传转化植株假阳性率的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速有效地降低花生遗传转化植株假阳性率的筛选方法，属于作物育苗技术领域。

背景技术

花生是我国重要的油料作物和经济作物，具有非常重要的经济价值。自上世纪40年代以来，逐步开始了花生组织培养研究，建立多种花生组培再生体系。自1994年Eapen和George首次报道获得花生转基因植株以来，有关进行花生遗传转化的研究也有不少成功的报道。

虽然花生的遗传转化取得了一定的进展，能够通过农杆菌介导的方法获得转基因花生再生植株，但是花生转化与再生频率较低，不能满足运用基因工程进行大规模花生遗传育种的需要。究其原因有以下几点：(1)转化效率受基因型影响较大：不同基因型花生的转化效率差异显著。(2)不同的花生外植体再生植株频率差异显著：目前已经成功获得再生植株的花生外植体主要是幼苗或萌发种子的下胚轴、幼叶和子叶，其中以下胚轴再生植株频率较高，周期较短。(3)转化效率低，转化植株假阳性较多，从而大大增加了后期的工作量，但收获甚少。(4)再生植株生根十分困难。人们想出了多种方法、配制了多个配方来解决这个问题，其中嫁接是较为成功的一种方法，但是嫁接苗成活率不是很高，且可能会有作为砧木的野生花生小芽混入。

目前常用的筛选转化假阳性植株的方法为向培养基中加入卡那霉素(Kan)。如中国专利文献CN103004585A(申请号201210534830.3)公开了一种利用卡那霉素快速筛选菊花转基因植株的方法，包括以下几个步骤：(1)确定菊花叶盘不定芽分化Kan筛选浓度、菊花茎段生根Kan筛选浓度以及Kan溶液浸泡筛选浓度和观察时间；(2)对菊花转化植株进行分化再生阶段和生根阶段的筛选得到生根株系；再将生根株系经Kan溶液浸泡筛选后得到转基因菊花Kan抗性株系；(3)转基因菊花的PCR验证：根据转基因载体中的35S启动子序列设计引物对筛选的转基因菊花Kan抗性株系进行PCR扩增，验证载体片段是否插入菊花基因组。但上述方法应用于花生转化植株假阳性筛选过程中，由于先培养再进行筛选，从而导致大量假阳性植株经过了培养阶段，导致工作量增加。

花生遗传转化的过程可以分为4个阶段：丛生芽诱导、伸长、筛选和生根，通常都是在筛选阶段施加选择压力进行选择，但是这个过程一般只有1月左右，时间短，导致产生大量假阳性植株；如果增加筛选时间，又会延长整个遗传转化周期。而且由于诱导和伸长阶段无选择压力，需要把所有的丛生芽都进行继代培养，工作量很大。

发明内容

本发明针对目前花生遗传转化中转化植株假阳性较多的问题，提供了一种快速有效地降低花生遗传转化植株假阳性率的筛选方法。

术语解释：

IBA：吲哚丁酸；NAA：萘乙酸；GA3：赤霉素GA3；Kan：卡那霉素；Cef：头孢曲松钠；VB₁：维生素B₁；6-BA：6-苄氨基腺嘌呤；

本发明技术方案如下：

一种快速有效地降低花生遗传转化植株假阳性率的筛选方法，步骤如下：

(1)挑取转染具有卡那抗性重组质粒或具有卡那抗性质粒的待转化的农杆菌单菌落接种于含卡那霉素(Kan)和利福平的YEP液体培养基中，培养至对数生长期，经固液分离，收集菌体沉淀，经液体MS基本培养基重悬，制得待转化菌液；

(2)切取花生幼苗的下胚轴，浸入步骤(1)制得的待转化菌液中进行转化，然后移至B培养基中，黑暗条件下共培养2～3天，经质量浓度为1％的头孢水溶液浸泡后，无菌水冲洗、晾干，制得转化后下胚轴；

所述的B培养基为在MS基本培养基的基础上每升加入0.6～0.8mg NAA和7.5～8.5mg6-BA；

(3)将步骤(2)制得的转化后下胚轴移至C培养基中，经16h光照/8h黑暗条件下培养20～30天，挑取绿色植株芽，制得初步筛选植株芽；

所述的C培养基为在MS基本培养基的基础上每升加入0.6～0.8mg NAA、7.5～8.5mg6-BA、200～250mg Cef和50～75mg Kan；

(4)将步骤(3)挑取的初步筛选植株芽移至D培养基中，经16h光照/8h黑暗条件下培养20～30天，挑取绿色植株芽，制得中度筛选植株芽；

所述的D培养基为在MS基本培养基的基础上每升加入2.0～3.0mg GA3、2.0-3.0mg6-BA、200～250mg Cef和90～100mg Kan；

(5)将步骤(4)制得的伸长植株芽移至E培养基中，经16h光照/8h黑暗条件下培养20～30天，挑取绿色植株芽，制得深度筛选植株芽；